■楊 雪 王洪榮 鄒益東 朱建泉

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.宜興天石飼料有限公司，江蘇宜興 214200)

甜菜堿是廣泛存在于自然界中的各種動(dòng)植物體內(nèi)的一種天然營養(yǎng)物質(zhì)，甜菜堿因?yàn)槠洫?dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在生命有機(jī)體中發(fā)揮著多種功能：可作為甲基供體部分取代蛋氨酸和膽堿，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)脂肪分解代謝，提高酮體瘦肉率，提高維生素的效價(jià)，調(diào)節(jié)滲透壓，提高抗球蟲藥療效，抗應(yīng)激，理想的誘食劑。已作為一種飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中。

目前測(cè)定甜菜堿含量的方法包括：酸堿滴定法、凱氏定氮法、紫外分光光度法、高氯酸非水滴定法、離子色譜法等。各種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，但綜合考慮，離子色譜法與高氯酸非水滴定法的測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。為了比較這兩種方法的測(cè)定結(jié)果如何，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

瑞士萬通792 Basic IC標(biāo)準(zhǔn)型離子色譜儀，上海良平精密分析天平MP200A（上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn)），KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)），電熱鼓風(fēng)干燥箱（南通金石實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)），79-1磁力加熱攪拌器（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 非水滴定法測(cè)定甜菜堿含量

1.2.1.1 非水滴定法的實(shí)驗(yàn)原理

甜菜堿在水溶液中呈中性，無法在水溶液中用酸堿滴定法直接測(cè)定其含量。但以冰醋酸作為溶劑，用HClO4為滴定劑，則能準(zhǔn)確滴定。以結(jié)晶紫為指示劑，滴定終點(diǎn)時(shí)溶液由紫色變?yōu)樗{(lán)色。滴定劑常用鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定，同樣以結(jié)晶紫為指示劑。

1.2.1.2 材料與試劑

試劑：冰乙酸、醋酸酐、結(jié)晶紫指示劑、高氯酸、5種甜菜堿樣品（宜興天石飼料有限公司）、甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（宜興天石飼料有限公司，含量98%）。

設(shè)備：分析天平、250 ml燒杯、50 ml量筒、2 ml移液管、磁力攪拌器、25 ml酸式滴定管、79-1磁力加熱攪拌器（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)）。

1.2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品處理：分別取適量的5種待測(cè)甜菜堿樣品,放于烘箱在（105±2）℃條件下烘2 h,粉碎,過100目篩,放于干燥器內(nèi)備用。

0.1 mol/l高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定：稱取一定量的高氯酸，注入冰乙酸和乙酸酐，以結(jié)晶紫為指示液，滴定鄰苯二甲酸氫鉀，溶液由紫色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，即為滴定終點(diǎn)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。最終測(cè)得高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c為0.097 9 mol/l。

2%結(jié)晶紫指示液的配制：準(zhǔn)確稱取0.2 g結(jié)晶紫，用冰乙酸定容至100 ml。

稱樣：準(zhǔn)確稱取0.2 g甜菜堿樣品(準(zhǔn)確至0.000 1 g),置于250 ml燒杯中。

滴定：分別量取50 ml的冰醋酸和2 ml乙酸酐加入到燒杯中，攪拌均勻。將燒杯中加入2～3滴0.2%的結(jié)晶紫指示劑,用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行滴定,滴定的同時(shí)用磁力攪拌器攪拌。當(dāng)溶液顏色由紫色變?yōu)樗{(lán)綠色時(shí)即為終點(diǎn),記錄消耗的高氯酸溶液的體積V1(ml)。同時(shí)做空白試驗(yàn)，記錄消耗的高氯酸溶液的體積為V0(ml)。

根據(jù)公式W(%)=[c（V1-V0）×117.15×100]/m，計(jì)算甜菜堿的含量（其中V0=0.05 ml）。測(cè)得5種甜菜堿樣品的甜菜堿含量分別為：97.6%、68.5%、50.3%、31.3%、11.9%。

精密度實(shí)驗(yàn)：取3號(hào)甜菜堿樣品，按照上述方法，重復(fù)滴定5次，記錄滴定數(shù)據(jù)，5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD為0.78%。

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)：甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（含量98%）三份，按照上述方法，重復(fù)滴定3次，試驗(yàn)結(jié)果為98.8%。

回收率實(shí)驗(yàn)：分別取3號(hào)甜菜堿樣品1.3 g和甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品0.7 g，按照上述步驟進(jìn)行滴定。平行測(cè)定5份，記錄消耗的高氯酸體積。測(cè)得平均回收率97.8%。

1.2.2 離子色譜法測(cè)定甜菜堿含量

1.2.2.1 原理

用水溶解實(shí)驗(yàn)中的甜菜堿，溶液經(jīng)過液-液萃取凈化，將提取液稀釋至合適的濃度后，使用陽離子交換柱和非抑制性電導(dǎo)檢測(cè)器分離測(cè)定。

1.2.2.2 材料與試劑

試劑：甜菜堿樣品（宜興天石飼料有限公司）、甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（宜興天石飼料有限公司，含量98%）、乙腈、去離子水、0.45 μl系膜。

設(shè)備：瑞士萬通792 Basic IC標(biāo)準(zhǔn)型離子色譜儀，上海良平精密分析天平MP200A（上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn)），KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)），電熱鼓風(fēng)干燥箱（南通金石實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）、100 ml容量瓶、50 ml容量瓶、5 ml移液管、濾紙、漏斗。

1.2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品處理：分別取適量的5種待測(cè)甜菜堿樣品,放于烘箱在（105±2）℃烘2 h,粉碎,過100目篩,放于干燥器內(nèi)備用。

色譜分析條件：通過對(duì)流動(dòng)相、流速、柱溫的優(yōu)化，確定甜菜堿的色譜分析條件為：乙腈∶水（75∶925）為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μl。

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g于105℃干燥過的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（含量為98%）于100 ml容量瓶中定容，放在超聲波清洗儀內(nèi)，作用20 min后，冷卻至室溫。

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取50.0、25.0、5.0、2.5、0.5 ml甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 ml容量瓶中，用水定容。該標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為1、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/ml（該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）。5種溶液各進(jìn)樣20 μl，按上述色譜條件進(jìn)行分析（色譜分析時(shí)，過0.45 μl的系微孔濾膜）。將測(cè)定結(jié)果以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到甜菜堿含量的回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

甜菜堿實(shí)驗(yàn)品的含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取1 g于105℃干燥過的甜菜堿樣品，定容至100 ml，用超聲波清洗儀作用20 min，冷卻后，過濾，吸取濾液5 ml于50 ml容量瓶中定容?；靹颍o置20 min后，按照上述色譜條件進(jìn)行分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算甜菜堿含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得5種甜菜堿樣品的濃度見表1。

圖1 甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 5種甜菜堿樣品的甜菜堿含量

精密度實(shí)驗(yàn)：吸取3號(hào)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測(cè)得相對(duì)保留時(shí)間RSD值＜0.3%，相對(duì)峰面積RSD值為0.9%～1.7%。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：按甜菜堿試驗(yàn)品的配制方法制得樣品溶液，分別于配制后0、1、3、5、10、15、25 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。測(cè)得7個(gè)時(shí)間點(diǎn)甜菜堿峰面積的RSD值為0.7%～1.2%。

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)：取甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（含量98%）三份，按照上述方法，連續(xù)進(jìn)樣3次，試驗(yàn)結(jié)果為97.9%。

回收率實(shí)驗(yàn)：取已知含量的3號(hào)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各1.000 0 g，分別定容到100 ml，過濾，再分別取5 ml定容到50 ml，標(biāo)號(hào)①、②。?、偬?hào)溶液10 ml，②號(hào)溶液5 ml，連續(xù)進(jìn)樣5次。按照上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，測(cè)定平均回收率。測(cè)得平均回收率為101.4%。

圖2 甜菜堿樣品離子色譜陽離子分析

2 結(jié)果及分析

2.1 非水滴定法和離子色譜法測(cè)定的不同樣品的甜菜堿含量

按照測(cè)得甜菜堿濃度由高到低的順序，列于表2。

表2 非水滴定法和離子色譜法測(cè)定的不同樣品的甜菜堿含量（%）

由表2可知，相比較而言，離子色譜法測(cè)得的甜菜堿含量更接近甜菜堿的實(shí)際值。由以上結(jié)果可知，非水滴定法測(cè)定的甜菜堿濃度均比離子色譜法測(cè)定的甜菜堿濃度高，原因可能是：①甜菜堿是一種中性物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的吸濕性能，可能是測(cè)定過程中甜菜堿由于吸濕導(dǎo)致了滴定終點(diǎn)誤差；②由于操作人員的讀數(shù)存在誤差；③滴定終點(diǎn)的確定存在誤差；④冰醋酸中水分含量較高。

2.2 高效液相色譜法測(cè)定甜菜堿含量的方法分析

本實(shí)驗(yàn)過程中，選擇不同比例的乙腈與水的比例為流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：乙腈∶水（75∶925）為流動(dòng)相，流速：1.0 ml/min，柱溫：35 ℃，分離度較好，達(dá)到基線分離。

離子色譜法是將改進(jìn)后的電導(dǎo)檢測(cè)器安裝在離子交換樹脂柱的后面，以連續(xù)檢測(cè)色譜分離的離子的方法。1975年H·斯莫爾等將經(jīng)典的離子交換色譜與高效液相色譜技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)造了使用連續(xù)電導(dǎo)檢測(cè)器的現(xiàn)代離子色譜法，它與經(jīng)典的離子交換色譜的區(qū)別在于分離柱的高效能，即現(xiàn)代離子色譜使用小粒度和低交換容量的樹脂及小柱徑的分離柱，以及進(jìn)樣閥進(jìn)樣，泵輸送洗脫液,連續(xù)檢測(cè),具有快速、方便，靈敏度高，選擇性好，可同時(shí)分析多種離子化合物，分離柱的穩(wěn)定性好、容量高等優(yōu)點(diǎn)。

3 討論

離子色譜法測(cè)定甜菜堿含量具有連續(xù)、高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間較長，包括稱量、定容、超聲波、冷卻、稀釋、測(cè)定等步驟，而高氯酸非水滴定法雖測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較離子色譜法準(zhǔn)確性低，但實(shí)驗(yàn)操作簡單，只需稱量、處理、滴定即可。并且，高氯酸非水滴定法所需的試劑和設(shè)備均為常用試劑和設(shè)備，而離子色譜法所用的設(shè)備價(jià)格較昂貴。所以，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)條件，若所測(cè)結(jié)果不需要特別準(zhǔn)確，則可選擇高氯酸非水滴定法，該方法價(jià)格相對(duì)合理并且快速，且試劑均為常見試劑。若對(duì)所測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求很高，則可選擇精確度與準(zhǔn)確度均較高的離子色譜法進(jìn)行測(cè)定。