具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌對(duì)高血脂癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用

王俊國(guó)，孟和畢力格，包秋華，丹 彤，王麗鳳，張和平*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌對(duì)高血脂癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用

王俊國(guó)，孟和畢力格，包秋華，丹 彤，王麗鳳，張和平*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

目的：篩選出具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其降血脂的效果。方法：通過瓊脂平板測(cè)試法和高效液相色譜法(HPLC)對(duì)乳桿菌膽鹽水解酶活力進(jìn)行定性和定量測(cè)試，篩選出具有膽鹽水解酶活性的乳桿菌灌胃高脂血癥大鼠；將雄性Wistar大鼠24只按體質(zhì)量約相等分為正常對(duì)照組、高脂模型組及實(shí)驗(yàn)組，后兩組給予高脂飼料喂養(yǎng)，并每日一次給這3組分別灌胃0.9%生理鹽水、脫脂乳和活菌制劑，28d后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：L. fermentum MGH13-1具有較高的膽鹽水解酶活性，將其灌胃大鼠后，實(shí)驗(yàn)組血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯等含量明顯低于高脂模型組(P＜0.05)，肝臟中的膽固醇含量明顯低于高脂模型組(P＜0.05)，糞便中的膽固醇、膽酸及短鏈脂肪酸含量明顯高于高脂模型組(P＜0.05)。結(jié)論：具有膽鹽水解酶活性的L. fermentum MGH13-1對(duì)高脂血癥大鼠有明顯的降血脂作用。

乳酸菌；L. fermentum MGH13-1；膽鹽水解酶；高脂血癥大鼠；降血脂作用

血液中過高的膽固醇含量是引起冠心病和心腦血管疾病的主要原因[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年，在所有因病死亡的人數(shù)中約有40%人死于高膽固醇引起的疾病[2]。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)常食用一些益生菌(主要是乳酸菌)的發(fā)酵制品及其制劑有助于降低血液膽固醇的含量[3-5]。近年來許多研究表明乳酸菌降低血液膽固醇與該乳酸菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)活力密切相關(guān)[6-7]。

膽鹽水解酶是微生物生長(zhǎng)、繁殖過程中產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。該酶主要由乳酸菌產(chǎn)生，能水解結(jié)合態(tài)牛磺酸膽鹽和甘氨酸膽鹽，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽酸[6]。在人體內(nèi)，膽鹽的排泄是體內(nèi)消除膽固醇的主要途徑，也是膽固醇代謝的重要方式。膽鹽水解酶在肝腸循環(huán)中可將結(jié)合膽酸鹽降解為游離膽酸，而游離膽酸在體內(nèi)溶解性很低，從而促進(jìn)了膽鹽的排泄[8]。為了彌補(bǔ)膽鹽的損失，維持正常的肝腸循環(huán)就必須有部分膽固醇合成新的膽鹽來補(bǔ)充排泄掉的那部分(膽固醇是膽鹽的前體物質(zhì))，從而起到降低血液膽固醇的作用[6-7]。

在20世紀(jì)70年代，人們就已在幾種腸道固有的乳酸菌中發(fā)現(xiàn)了膽鹽水解酶，并提出其與降低膽固醇有關(guān)的觀點(diǎn)[9-10]，而后來的研究進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)，口服含有膽鹽水解酶活性的乳酸菌確實(shí)可以降低動(dòng)物體內(nèi)血清膽固醇的水平[11-13]。人們?cè)絹碓疥P(guān)注膽酸鹽水解酶和乳酸菌降膽固醇之間的關(guān)系，在菌株的篩選上，是否具有膽酸鹽水解酶活性已成為一個(gè)重要的指標(biāo)[6]。

本研究的目的在于從分離自蒙古國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的7株乳桿菌中篩選出具有膽鹽水解酶活性的乳桿菌菌株，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其降血脂的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從蒙古國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中篩選出的7株耐酸性、耐膽鹽較好的菌株：MGH2-1-1、MGH7-2、MGH13-1、MGH15-1、MGH17-2b、MGH16-1、MGH14-1。以上菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS培養(yǎng)基、10%脫脂乳培養(yǎng)基、BCP瓊脂培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)[14]提供方法配制；氯化鈣、甲醇、巰基乙酸鈉、二硫蘇糖醇、冰醋酸 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫氧?；悄懰徕c(分析純)、甘氨膽酸鈉(分析純)、甘氨酸(色譜純) 美國(guó)Sigma公司；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；總膽汁酸試劑盒 英國(guó)Ranbox公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量約為120～140g的5周齡雄性Wistar系大鼠24只，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備

HA-300M 型全自動(dòng)高壓滅菌器 日本Hirayama公司；GS-15R 型離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；STACS45F恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司；BBL厭氧培養(yǎng)罐日本東化學(xué)株式會(huì)社；Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)(配Sep-PakC18柱和可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化

將在脫脂乳培養(yǎng)基中冷凍干燥保存的供試菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代。

1.4.2 膽鹽水解酶活力的定性檢測(cè)[15]

在MRS液體培養(yǎng)基中添加0.3%脫氧牛磺膽酸鈉(TDCA)、0.2%巰基乙酸鈉(THIO)、0.37g/L CaCl2和1.5%瓊脂；121℃ 15min滅菌后傾倒入滅菌平皿中，凝固后倒置放入?yún)捬豕?BBL)中48h后取出。將無菌濾紙片放入平皿中，在每個(gè)濾紙片上滴加10μL菌液，平皿再次放入?yún)捬豕拗校?7℃培養(yǎng)72h。觀察濾紙片周圍有無白色沉淀物生成。

1.4.3 膽鹽水解酶活力的定量檢測(cè)[15]

將供試菌株，按2%接種量接種于含有0.3%甘氨膽酸鈉的200mL MRS-THIO培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，通過HPLC測(cè)BSH活力。BSH的活力以菌株在24h培養(yǎng)后每升培養(yǎng)液中所含的游離甘氨酸的毫摩爾數(shù)表示，單位是mmol/L，同時(shí)選取未接菌的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。

HPLC色譜條件：Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)：裝配 Sep-PakC18(100mmh8mm)柱，熒光檢測(cè)波長(zhǎng)205nm，進(jìn)樣量為20μL，峰面積計(jì)算用ChemResearch Software，樣品的流速1.0mL/min，所用有機(jī)溶劑均為色譜純。

流動(dòng)相：700mL甲醇和300mL 0.02mol/L乙酸混合，用5mol/L NaOH調(diào)其pH值為5.6，通過0.45μm聚丙烯過濾器過濾。

配制2.00mmol/L甘氨酸的溶液，作為標(biāo)樣，并稀釋至0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mmol/L，利用HPLC法測(cè)定甘氨酸含量。HPLC條件與樣品相同，以甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)(x，mmol/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(y, mAU)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=949.66x(R2=1)。

1.4.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)菌株的制備

將篩選出的具有膽鹽水解酶活性的乳桿菌菌株接種于MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，經(jīng)離心(3000hg，10min)收集菌體，用滅菌生理鹽水離心洗滌后，加入10%滅菌脫脂乳，并調(diào)整其菌數(shù)約為2.0h109CFU/mL，混勻后用BCP瓊脂培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，計(jì)活菌數(shù)確認(rèn)。將菌體脫脂乳懸液按每日使用量分裝于冷凍瓶中，置—85℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方式

將Wistar系大白鼠購(gòu)進(jìn)后，水和營(yíng)養(yǎng)飼料自由采食飼喂至第7天。在第7天稱體質(zhì)量后，按每個(gè)實(shí)驗(yàn)組平均體質(zhì)量約相等分為正常對(duì)照組、高脂血癥模型組(模型組)、實(shí)驗(yàn)組(乳酸菌組)，每組8只大鼠。對(duì)照組喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料(22%酪蛋白、47%玉米淀粉、2.2%纖維素、1.1%維生素、3.7%礦物質(zhì)混合物、24%蔗糖)，模型組、實(shí)驗(yàn)組均喂以在標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加1%膽固醇、10%豬油及0.2%膽酸鈉的高脂飼料，每組分別按2mL/只灌胃，分組及灌胃情況具體如表1所示。

表 1 實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃成分設(shè)計(jì)(n=8)Table 1 Grouping and administration of rats(n=8)

1.4.6 樣品采集與分析測(cè)試

末次給藥后(即實(shí)驗(yàn)第28天)將大鼠禁食一夜，心臟采血后致死，無菌操作臺(tái)中解剖，取出肝臟樣品冷凍保藏。血液經(jīng)離心(3000hg，10min)分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量；將實(shí)驗(yàn)最后3d隨機(jī)收集的大鼠糞便進(jìn)行冷凍干燥處理后，分別取糞便及肝臟樣品，用甲醇-氯仿混合液(體積比2:1)，45℃水浴提取 1h，8000hg離心10min后，用鄰苯二甲醛比色法測(cè)定膽固醇含量[16]；取冷凍干燥后糞便樣品0.3g，加入3mL去離子水于研磨器中進(jìn)行研磨，完全磨碎后離心(3000hg，10min)后，取上清液分為兩份，其中一份在全自動(dòng)生化分析儀上，用總膽汁酸測(cè)定試劑盒(Randox, BI1689/S)測(cè)定糞便中膽汁酸含量[17]；另一份上清液中加入同體積的氯仿混合后離心(8000hg，10min)，取上清液通過HPLC測(cè)定糞便中的短鏈脂肪酸[17]。Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)，裝配Zorbax SB C18柱，柱溫：65℃；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：0.025mol/L磷酸；流速：0.6mL/min。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS12.0系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽鹽水解酶活性的定性檢測(cè)結(jié)果

在7株實(shí)驗(yàn)菌株中，僅有MGH13-1在濾紙片周圍產(chǎn)生明顯的白色沉淀，見圖1。當(dāng)具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌在含有脫氧?；悄懰徕c的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，可以將結(jié)合膽鹽分解為游離膽酸，而培養(yǎng)基中添加的CaCl2與游離膽酸反應(yīng)，產(chǎn)生白色沉淀。因此，推斷MGH13-1具有膽鹽水解酶活性。

利用16S rDNA序列同源性分析對(duì)這株菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示MGH13-1是發(fā)酵乳桿菌(L. fermentum)，在GenBank序列注冊(cè)號(hào)是FJ640989。

圖 1 乳桿菌膽鹽水解酶活力的檢測(cè)Fig.1 BSH activity of strain MGH13-1

2.2 膽鹽水解酶活性的定量檢測(cè)結(jié)果

圖 2 利用HPLC法對(duì)菌株膽鹽水解酶活力的測(cè)定Fig.2 HPLC analysis of glycine produced from bile salt hydrolysis by strain MGH13-1

由圖2可知，用HPLC法測(cè)定出MGH13-1產(chǎn)生的峰面積是298.4350mAU。根據(jù)1.4.3節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)應(yīng)的甘氨酸濃度是0.3143mmol/L，即其膽鹽水解酶活力為0.3143mmol/L。

通過HPLC對(duì)其余6株菌的膽鹽水解酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示這些菌株水解膽鹽產(chǎn)生的甘氨酸含量極低，表明它們的膽鹽水解酶活性較弱(數(shù)據(jù)未顯示)。這也進(jìn)一步證實(shí)了利用瓊脂平板測(cè)試法篩選具有膽鹽水解酶活性菌株的準(zhǔn)確性。

2.3 灌胃L. fermentum MGH13-1對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響

圖 3 灌胃對(duì)高血脂癥大鼠血脂的影響Fig.3 Effect of L. fermentum MGH13-1 on serum TC, TG, HDL-C and LDL-C in hyperlipidemic rats

如圖3所示，與正常對(duì)照組比，模型組動(dòng)物TC、TG、LDL-C明顯升高(P＜0.05)，說明高脂血癥動(dòng)物模型建立成功；與模型組比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物TC、TG、LDL-C明顯降低(P＜0.05)表明灌胃菌株對(duì)高脂血癥大鼠有一定的降血脂作用；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的TC、TG、LDL-C明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，這表明給高脂血癥大鼠灌胃菌株L. fermentum MGH13-1雖然能在一定程度上降低血脂濃度，但是不能完全恢復(fù)到正常狀態(tài)。同時(shí)注意到HDL-C的濃度在不同組間沒有明顯變化。

2.4 灌胃L. fermentum MGH13-1對(duì)高脂血癥大鼠肝臟及糞便中TC含量的影響

圖 4 灌胃L. fermentum MGH13-1 對(duì)高脂血癥大鼠肝臟中TC含量的影響Fig.4 Effect of L. fermentum MGH13-1 on liver TC in hyperlipidemic rats

由圖4、5可知，與正常對(duì)照組相比，模型組與實(shí)驗(yàn)組的肝臟及糞便中膽固醇的含量顯著增加(P＜0.05)，說明飲食來源中過多膽固醇會(huì)在肝臟內(nèi)大量貯存，同時(shí)無法被吸收利用的過多膽固醇會(huì)隨糞便被部分排出體外；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組可以顯著降低肝臟中膽固醇的含量(P＜0.05)，這表明L. fermentum MGH13-1可以減少膽固醇在肝臟中的積存；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組糞便中膽固醇的含量顯著增加(P＜0.05)，這說明灌胃L. fermentum MGH13-1可以促進(jìn)體內(nèi)膽固醇的排泄。

圖 5 灌胃L. fermentum MGH13-1 對(duì)高脂血癥大鼠糞便中TC含量的影響Fig.5 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal TC in hyperlipidemic rats

2.5 灌胃L. fermentum MGH13-1對(duì)高脂血癥大鼠糞便中膽酸及短鏈脂肪酸含量的影響

圖 6 灌胃L. fermentum MGH13-1 對(duì)高脂血癥大鼠糞便中總膽酸含量的影響Fig.6 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal TBA in hyperlipidemic rats

由圖6可知，灌胃含有BSH活性的乳酸菌菌株，其糞便中游離膽酸含量高于模型組及正常對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，這表明L. fermentum MGH13-1產(chǎn)生的膽鹽水解酶有可能將體內(nèi)的結(jié)合膽鹽水解成游離膽酸，后者因溶解度低，在體內(nèi)沉淀并隨糞便排出體外；同時(shí)模型組糞便中游離膽酸含量高于正常對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，推測(cè)可能是因?yàn)槟Ｐ徒M大鼠飼料中含有大量膽固醇及膽酸鹽，體內(nèi)為了調(diào)節(jié)膽固醇的代謝，其合成和分泌的膽鹽量也相應(yīng)增加，從而也促進(jìn)了膽鹽的代謝，故導(dǎo)致糞便中膽酸含量增加。

表 2 灌胃L. fermentum MGH13-1 對(duì)高脂血癥大鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響(±s, n＝8)Table 2 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal SCFA in hyperlipidemic rats(±s, n＝8)

表 2 灌胃L. fermentum MGH13-1 對(duì)高脂血癥大鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響(±s, n＝8)Table 2 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal SCFA in hyperlipidemic rats(±s, n＝8)

注：表中數(shù)據(jù)以糞便干質(zhì)量計(jì)。

45.86f2.19b7.15f0.23a丁酸4.89f0.31a3.16f0.21b3.51f0.15b短鏈脂肪酸正常對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組乙酸丙酸53.81f3.02a6.44f0.23b43.52f3.11b5.11f0.58c

與模型組相比，正常對(duì)照組顯示出糞便中含有較高濃度的短鏈脂肪酸(表2)，這表明高脂飼料有可能引起了體內(nèi)微生物環(huán)境的改變，從而影響了有機(jī)酸的產(chǎn)生；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組可以顯著增加糞便中短鏈脂肪酸的含量(P＜0.05)，特別是丙酸；這表明灌胃L. fermentum MGH13-1可以促進(jìn)體內(nèi)腸道短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。

3 討 論

Patel等[6]認(rèn)為具有膽鹽水解酶活性的益生菌降膽固醇的能力高于沒有膽鹽水解酶活性的益生菌，因此從降低膽固醇的目的出發(fā)，如何準(zhǔn)確地篩選出具有BHS活性的乳酸菌是非常重要的。自從Dashkevicz等[18]提出利用瓊脂平板法檢測(cè)乳桿菌的膽鹽水解酶后，許多研究者逐步完善了這一方法，并成功地對(duì)具有BHS活性的乳酸菌進(jìn)行了體外定性篩選[15,19]。利用HPLC法對(duì)BHS活性的定量檢測(cè)也被大量研究者證實(shí)是準(zhǔn)確和可靠的[15,19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在瓊脂平板上產(chǎn)生沉淀圈的菌株，利用HPLC測(cè)得的甘氨酸濃度也高，相反沒有產(chǎn)生沉淀圈的，測(cè)得的甘氨酸濃度極低。因此通過對(duì)7株乳桿菌的檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)了這兩種方法的可靠性。

Elkins[20]、Maire[21]認(rèn)為有膽鹽水解酶活力的菌株必須來源于富含有膽鹽的環(huán)境，例如分離自人或動(dòng)物的腸道或糞便，而通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離自發(fā)酵乳制品的菌株也具有膽鹽水解酶活力，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似，Mathara[22]、Maragkoudakis[23]等從發(fā)酵乳制品這種非膽鹽環(huán)境中分離出了具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌，所以認(rèn)為具有膽鹽水解酶活力的菌株并不一定要來自富含膽鹽的環(huán)境。

人們通常認(rèn)為血清中高濃度的TC與LDL-C是引起心血管疾病的主要因素，降低高膽固醇人群的TC與LDL-C濃度可以減少心血管疾病的發(fā)病率。通過給大鼠灌胃L. fermentum MGH13-1能使高脂血癥大鼠的TC、TG、LDL-C含量明顯降低(P＜0.05)，這說明其具有較好的降血脂作用，許多研究者也曾得到過類似的結(jié)論[2-4]。盡管有研究顯示灌胃乳酸菌可以使HDL-C升高[24-25]，但在本實(shí)驗(yàn)中灌胃L. fermentum MGH13-1并沒有使HDL-C發(fā)生明顯的變化，類似的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果被許多研究者報(bào)道過[3,26]。

與正常對(duì)照組相比，飼喂高脂飼料可以使大鼠體內(nèi)肝臟膽固醇含量顯著增加(P＜0.05)，而灌胃L. fermentum MGH13-1后可以顯著降低肝臟中膽固醇的含量(P＜0.05)。這表明L. fermentum MGH13-1確實(shí)可以降低高血脂癥大鼠體內(nèi)的膽固醇，而不是簡(jiǎn)單地將膽固醇從血液轉(zhuǎn)移到肝臟中。

與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組糞便中膽固醇的含量顯著增加(P＜0.05)，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的可能原因主要有：乳酸菌直接將膽固醇吸收或吸附在菌體上并隨糞便排出體外；或乳酸菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶在腸道內(nèi)將結(jié)合膽鹽變?yōu)橛坞x膽鹽，游離膽鹽的增多使膽固醇在腸道的吸收率下降，導(dǎo)致糞便中膽固醇增多[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)糞便中膽酸進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)灌胃L. fermentum MGH13-1會(huì)明顯增加糞便中膽酸含量(P＜0.05)，這表明L. fermentum MGH13-1利用膽鹽水解酶將結(jié)合膽鹽變?yōu)橛坞x膽鹽，由于游離膽鹽的乳化性能較低，這導(dǎo)致體內(nèi)膽固醇等脂溶性物質(zhì)的吸收量下降并隨糞便排出體外，此外，通過前期體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)L. fermentum MGH13-1降低培養(yǎng)基中膽固醇的主要原因是由于在低pH值下膽固醇與游離膽酸共同沉淀的結(jié)果，據(jù)此認(rèn)為由于L. fermentum MGH13-1利用膽鹽水解酶將結(jié)合膽鹽變?yōu)橛坞x膽鹽，游離膽鹽的增多使膽固醇在腸道的吸收率下降，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組糞便中膽固醇含量的顯著增加。

L. fermentum MGH13-1含有的膽鹽水解酶對(duì)體內(nèi)血脂的代謝有著重要意義。灌胃L. fermentum MGH13-1會(huì)明顯增加糞便中膽酸含量(P＜0.05)，這表明膽鹽水解酶可將體內(nèi)的結(jié)合膽鹽水解為游離膽鹽，而在腸道中游離膽鹽的溶解性較低，導(dǎo)致其隨糞便一起排出體外，為彌補(bǔ)損失的膽鹽，體內(nèi)將有一定量的膽固醇重新合成膽鹽，進(jìn)而降低了體內(nèi)的膽固醇[6]；同時(shí)由于游離膽鹽的乳化性能較低，這導(dǎo)致體內(nèi)膽固醇等脂溶性物質(zhì)的吸收量下降并隨糞便排出體外[7]，從而也起到了體內(nèi)降低血脂的作用。

與模型組相比，灌胃L. fermentum MGH13-1可以顯著增加糞便中的短鏈脂肪酸含量(P＜0.05)，特別是丙酸含量。研究[7]發(fā)現(xiàn)益生菌可以在體內(nèi)發(fā)酵一些膳食纖維導(dǎo)致短鏈脂肪酸的增加，而短鏈脂肪酸特別是丙酸可以通過抑制肝臟膽固醇的合成或通過將血液和肝臟的膽固醇重新分配，達(dá)到降低血液膽固醇的目的。有研究[27-29]指出丙酸能夠抑制肝臟中脂肪酸及膽固醇的合成，而肝臟為了維持正常的生理機(jī)能，只能從血液中攝取膽固醇等脂類，因此可以降低體內(nèi)血脂的含量。因此推斷L. fermentum MGH13-1可能在腸道內(nèi)定殖，發(fā)酵食物中的碳水化合物導(dǎo)致腸道中短鏈脂肪酸的增多，丙酸的增加抑制了肝臟膽固醇及脂肪酸的合成，這也是導(dǎo)致了肝臟及血液中膽固醇含量減少的一個(gè)原因。

綜合以上結(jié)果可知，經(jīng)體外篩選具有膽鹽水解酶活性的L. fermentum MGH13-1對(duì)患有高脂血癥大鼠有顯著的降血脂作用，其可能通過多種途徑達(dá)到降低體內(nèi)血脂的效果。從本實(shí)驗(yàn)看出L. fermentum MGH13-1降血脂與其具有膽鹽水解酶活性之間有著密切聯(lián)系，同時(shí)對(duì)于菌株L. fermentum MGH13-1而言，體內(nèi)短鏈脂肪酸特別是丙酸的增加對(duì)乳酸菌降低膽固醇也有著很大意義。其詳細(xì)的降膽固醇機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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Hypolipidemic Effect of Lactobacillus with Bile Salt Hydrolase Activity in Hyperlipidemic Rats

WANG Jun-guo，MENGHE Bilige，BAO Qiu-hua，DAN Tong，WANG Li-feng，ZHANG He-ping*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China)

Objective: To screen Lactobacillus with bile salt hydrolase (BSH) activity and to explore its hypolipidemic effect in hyperlipidemic rats. Methods: Agar plate assay and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used to detect and quantify bile salt hydrolase activity in Lactobacillus. Lactobacillus with excellent BSH activity was administrated by gavage to hyperlipidemic rats. Twenty-four male Wistar rats of similar body weight were divided into normal control, hyperlipidemia model and Lactobacillus treatment groups. The latter two groups were fed high fat diet. Three groups were administrated by gavage with 0.9% normal saline, skim milk and skim milk inoculated with Lactobacillus once daily for 21 consecutive days and fasted overnight after the last administration. On the following day, blood and livers were taken for the determination of serum lipid indicators. Besides, rat stools were collected during the last three days of administration and tested for TC, total bile acid (TBA) and short-chain fatty acid (SCFA) levels. Results: Lactobacillus fermentum MGH13-1 showed excellent BSH activity. Serum of TC, TG and LDL-C levels and liver TC level were signif i cantly lower, while fecal TC, TBA and SCFA levels were signif i cantly higher in MGH13-1 treatment group, when compared to high fat model group (P ＜0.05). Conclusion: Lactobacillus MGH13-1 has a remarkable hypolipidemic effect in hyperlipidemic rats.

Lactobacillus；L. fermentum MGH13-1；bile salt hydrolase；hyperlipidemic rat；hypolipidemic effect

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0257-06

2012-01-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30840011；31160315)；中國(guó)科學(xué)院西部之光人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BJ08-18)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(200508010406；2011MS1205；20102010)

王俊國(guó)(1970ü)，男，副教授，博士，主要從事乳品微生物研究。E-mail：junguo379@yahoo.com.cn

*通信作者：張和平(1965ü)，男，教授，博士，主要從事乳品科學(xué)研究。E-mail：hepingdd@vip.sina.com