趙敏，汪長國，李寧，夏慶友，戴亞

1川渝中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，成都市成龍大道1段56號 610066;2 西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715;3 西南大學生物技術學院，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715

煙草（Nicotiana tabacum）是重要經(jīng)濟作物，也是植物學研究中的重要模式植物。汪長國等人從煙田土壤中分離篩選出的芽孢桿菌并制備成一種微生物制劑MP，采收前煙葉噴施MP制劑可改善煙葉重要香味成分和蛋白質含量，提高煙葉品質[1]。趙敏等人研究發(fā)現(xiàn)，噴施微生物制劑MP后煙葉中可能具有抗菌功能的組織蛋白酶B基因表達量增加[2]，與植物抗病性相關的幾丁質酶和逆滲透蛋白表達量也有增加[3]。但該制劑分泌的代謝產(chǎn)物含有哪些蛋白以及這些蛋白對煙葉品質的作用機制還有待于進一步研究。

“鳥槍法”（Shotgun）蛋白質學研究策略是基于復雜蛋白質混合物的酶解，它可以大規(guī)模的篩選復雜樣品中的多肽和蛋白，并快速鑒定細胞、組織和器官中的蛋白質表達譜[4-6]，其基本原理是蛋白質溶液或經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質條帶經(jīng)過酶解后形成肽段混合物，肽段混合物經(jīng)過一維液相色譜或二維液相色譜分離，串聯(lián)質譜檢測，然后通過在相應的數(shù)據(jù)庫中檢索，從而鑒定蛋白質。液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）的“鳥槍法”（Shotgun）蛋白質組學策略一次分析可以鑒定出上千個蛋白質，該技術已經(jīng)廣泛應用于一些模式植物中，如擬南芥[7-8]、大豆[9-10]、水稻[11]等。本實驗利用Shotgun蛋白質學方法分析鑒定微生物制劑MP代謝產(chǎn)物的蛋白質組成分，旨在揭示MP制劑改善煙葉品質的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

微生物制劑MP由汪長國等人從煙田土壤中分離、篩選出有益微生物（巨大芽孢桿菌， Bacillus magaterium）[1]。

1.1.2 試劑與儀器

APS、丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、硝酸銀、TEMED、β-巰基乙醇、尿素、檸檬酸、NH4HCO3、DTT購于BBI公司，考馬斯亮藍R-250、甘氨酸、SDS購自AMERSCO，甲酸、乙腈（ACN）、Trypsin、三氟乙酸（TFA）購自Sigma，IPTG購自TAKARA，預染蛋白質marker購自Fermentas，吲哚乙酸（IAA）購自GE，Econo-Pac Chromatography Column 購自Bio-Rad，KH2PO4、鹽酸、硫代硫酸鈉、甲醇、冰醋酸、甲醛、NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O、溴酚藍購自Sigma公司。

Hoefer SE600 Ruby 型垂直電泳儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI），LC-MS/MS購自Thermo Finnigan，San Jose，CA。

1.2 方法

1.2.1 微生物制劑MP代謝物的提取

將該微生物接種牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)72 h后取菌液，離心后取上清液過濾，得到代謝產(chǎn)物。

1.2.2 SDS-PAGE電泳檢測

將得到的代謝產(chǎn)物加入3×上樣緩沖液，煮沸離心后，取上清液進行電泳。進行SDS-PAGE電泳時，分離膠為12.5%，壓縮膠為5%。分別采用7 mA和15 mA的電流強度進行穩(wěn)流電泳。電泳結束后進行銀染。

銀染過程首先將凝膠在固定液中固定1 h以上；隨后，用清洗液浸泡3次；在定影液中反應2 min；用ddH2O洗滌3次；在染色液中反應30 min；ddH2O涮洗幾次；用顯影液浸泡數(shù)分鐘，直到顯出蛋白質條帶；加入停止液，反應終止；ddH2O洗凝膠3次，用10%的醋酸保存。

1.2.3 銀染染色膠酶解

將電泳條帶切下，在每管凝膠顆粒中加入200-400 μL脫色劑（30%ACN/100 mmol/L NH4HCO3）對凝膠進行脫色；清洗至透明，去除上清并凍干；加入100 mmol/L DTT，56℃孵化30 min；去上清，加入200 mmol/L IAA，暗處放置20 min；去上清，加入100 mmol/L NH4HCO3，室溫15 min；去上清，加入乙腈；5 min后吸去，凍干加入 2.5-10 ng/μL Trypsin溶液，在37℃條件下反應過夜；轉移酶解液到新的離心管中，凝膠中加入100 μL抽提液（60%ACN/0.1%TFA），超聲15 min，合并酶解液凍干。再將酶解液進行LC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 微生物制劑MP代謝產(chǎn)物分離及鑒定

將微生物制劑MP的主要成分巨大芽孢桿菌培養(yǎng)后提取并過濾，將過濾后的代謝產(chǎn)物通過SDS-PAGE鑒定，電泳結果見圖1。根據(jù)電泳結果，將MP制劑代謝產(chǎn)物SDS-PAGE膠條帶分為9段進行酶解。

圖1 微生物制劑MP代謝產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測

2.2 LC-MS/MS鑒定分析

利用Shotgun蛋白質學分析微生物制劑MP中的代謝產(chǎn)物蛋白質組成分。將MP制劑代謝產(chǎn)物SDSPAGE后的膠條帶進行LC-MS/MS鑒定分析（圖2）。最終，共鑒定了35個非重復蛋白質。分析鑒定蛋白的理論分布結果顯示，幾乎所有蛋白的分子量均大于20 kD，等電點均分布在4-7的范圍內(nèi)，只有1個蛋白的等電點大于8（表1）。鑒定蛋白的理論等電點和分子量見圖3。

圖2 微生物MP制劑代謝產(chǎn)物9個區(qū)段的質譜圖

圖3 微生物MP制劑代謝產(chǎn)物鑒定蛋白的理論等電點和分子量分布

表1 MP制劑代謝產(chǎn)物中鑒定的蛋白

續(xù)表1

2.3 KEGG代謝通路分析

為了進一步揭示所鑒定的MP制劑代謝產(chǎn)物中蛋白參與的代謝和通路，將這些鑒定的蛋白檢索KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）參考通路數(shù)據(jù)庫。結果顯示，所鑒定的蛋白幾乎都與代謝有關，其中參與氨基酸代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)、丙酮酸鹽代謝的蛋白最多（圖4）。除與代謝相關的蛋白外，還有一些蛋白參與蛋白降解。如氨基酰組氨酸二肽酶[12-13]、嗜熱菌狀金屬蛋白酶[14-15]、尿刊酸水合酶[16-17]、組氨酸氨裂解酶[18]。

圖4 MP制劑代謝產(chǎn)物中鑒定蛋白涉及的生物通路

3 小結與討論

煙葉中蛋白質含量與煙草品質密切相關。煙葉中蛋白質含量過高，在燃燒時會發(fā)出難聞的氣味，燃燒性能不良，制成品味苦、澀、辛辣，影響煙葉的香味品質和安全性[19]。上部煙葉蛋白質含量較高、煙堿含量較高、化學成分不協(xié)調(diào)等是制約上部煙葉工業(yè)可用性的重要因素。研究表明，微生物制劑MP能有效降低上部煙葉的蛋白質含量、增加香味成分并提高感官品質[1]。然而，該制劑分泌的代謝產(chǎn)物含有哪些蛋白以及這些蛋白對煙葉品質有怎樣的促進作用尚未研究清楚。對制劑分泌物的蛋白成分分析可促進我們對制劑性質的了解和對制劑的應用。

本研究主要利用shotgun LC-MS/MS結合生物信息學分析微生物MP制劑代謝產(chǎn)物的主要成分。結果顯示，切割的9條膠條帶共鑒定了35個非重復蛋白。這些蛋白的分子量均大于20 kD，等電點幾乎都分布在4-7的范圍內(nèi)，主要是參與各類代謝途徑以及蛋白降解的相關蛋白。

汪長國等人發(fā)現(xiàn)，噴施微生物MP制劑后煙葉中蛋白質的含量減少[1]。而我們鑒定MP制劑的代謝產(chǎn)物中有部分蛋白與蛋白降解相關，如氨基酰組氨酸二肽酶（Aminoacyl-histidine dipeptidase，PepD；EC 3.4.13.3）。該酶是金屬蛋白酶家族M20的成員之一，大多數(shù)金屬蛋白酶是Zn2+依賴酶，也有一些需要Mn2+、Co2+或者其他一些二價金屬離子。PepD酶催化裂解并釋放N末端氨基酸[12]，在蛋白成熟、降解、組織修復和細胞周期控制中具有重要作用[13]。嗜熱菌狀金屬蛋白酶也與蛋白降解相關，能降解不同生物學上重要的物質，比如膠原質、纖維連接蛋白、纖維蛋白原等[14]。我們推測MP制劑的代謝產(chǎn)物中這些具有蛋白降解功能的蛋白可能在煙草采摘及烤制等過程中促使煙葉中蛋白質降解進而使得蛋白質含量降低，進而提高煙葉的品質。

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