許金紅宋建國李永霞

（1中國人民解放軍海軍安慶醫(yī)院藥劑科，安徽安慶246003；2皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽蕪湖241002）

H PLC測定大鼠血漿中纈沙坦?jié)舛燃捌渌幋鷦恿W(xué)研究

許金紅1宋建國2李永霞1

（1中國人民解放軍海軍安慶醫(yī)院藥劑科，安徽安慶246003；2皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽蕪湖241002）

目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠血漿中纈沙坦?jié)舛鹊姆椒?，并考察其藥代動力學(xué)特征，為臨床合理用藥提供參考。方法：12只SD雄性大鼠隨機(jī)分成2組，于8:00及20:00分別灌胃給予纈沙坦（16 mg/kg），于給藥前及給藥后0.33、0.67、1、2、4、8、12及24 h眼內(nèi)眥靜脈取血，HPLC紫外法測定大鼠血漿纈沙坦?jié)舛?。結(jié)果：纈沙坦在大鼠體內(nèi)濃度（C）-時間（t）曲線呈一室模型，給藥后2 h達(dá)血藥峰值，8:00用藥t1/2（6.45±1.74）h。20:00用藥的Cmax顯著下降（P＜0.05），平均駐留時間（MRT）及t1/2延長（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：本方法測定血漿中纈沙坦?jié)舛葴?zhǔn)確、簡便，適用于纈沙坦藥代動力學(xué)研究。大鼠8：00用藥，血藥濃度較高，而t1/2較短；20:00用藥，血藥濃度偏低，t1/2延長。纈沙坦晝夜不同時間用藥對其藥代動力學(xué)有一定影響。

高效液相色譜法；纈沙坦；血藥濃度；晝夜節(jié)律；藥代動力學(xué)；實(shí)驗(yàn)研究

纈沙坦可用于各種類型高血壓，對心腦腎有較好的保護(hù)作用，并可選擇性阻斷AT1受體，而基本不影響AT2受體介導(dǎo)的血管擴(kuò)張及細(xì)胞修復(fù)、凋亡作用[1-2]。本品降壓具有強(qiáng)效、平穩(wěn)、長效的特點(diǎn)，降壓谷/峰比（T/P）值高，服藥后可24 h持續(xù)降壓且對清晨血壓降低作用優(yōu)于他藥[3-4]。本品以原形經(jīng)膽汁（約70%）及尿液排泄（約30%），肝、腎功能無嚴(yán)重障礙者用藥不受限制。參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[5-7]，本研究建立了簡單準(zhǔn)確的高效液相色譜法（HPLC）測定纈沙坦血藥濃度，可用于纈沙坦藥代動力學(xué)（藥動學(xué)）研究，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（515泵、717plus自動進(jìn)樣器、474FLD熒光檢測器、996PDAD檢測器、柱溫箱、Breeze色譜工作站），美國 Waters公司；XW-80A旋渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；TGL-16G高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DL系列溶劑過濾器，天津市東康科技有限公司；DN系列氮吹干儀，天津市東康科技有限公司；IKA-Werke TypVX2E型搖床，德國儀科公司；TG-322A微量分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Sartorius BS124S型電子天平，德國賽多利斯公司；PHS-2F型酸度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 纈沙坦（原中國藥品生物制品檢定所，批號 100651-200902，含量＞ 98%）；厄貝沙坦（原中國藥品生物制品檢定所，批號 100607-200301，含量＞98%）。

1.2.2 藥物 纈沙坦膠囊（80 mg/粒，北京諾華制藥有限公司，批號X1076）。

1.2.3 化學(xué)試劑 甲醇（色譜純，Merck公司）；乙腈（色譜純，Merck公司）；磷酸（分析純，無錫市亞盛化工有限公司）；三乙胺（分析純，上海精化科技研究所）。

2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雄性，購自上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證：2008001612491。動物置于明、暗周期下飼養(yǎng)（明暗各12 h，明期08:00-20:00），維持室溫20～25℃，相對濕度（60±10）%，自由進(jìn)食、進(jìn)水。給藥前禁食12 h，禁水2 h。

3 方法

3.1 色譜條件

色譜柱：Phecda C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相：取3.5 mL三乙胺，加水稀釋至500 mL，磷酸調(diào)pH至（3.0±0.1）。取上述溶液500 mL，加乙腈350 mL，甲醇150 mL，0.22 μm尼龍濾膜過濾，超聲脫氣。流速1.4 mL/min，柱溫30℃，檢測波長237 nm。

3.2 溶液配制

3.2.1 纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取纈沙坦10 mg，置100 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋至刻度，得100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液適量，用甲醇稀釋定容，配制成濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，－70℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取厄貝沙坦10 mg，置10 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 000 μg/mL的內(nèi)標(biāo)液，4℃避光保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鰞?nèi)標(biāo)液1 mL，置10 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋至刻度，得100 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。

3.3 給藥方案及血漿樣本采集

SD大鼠12只，隨機(jī)分為2組，每組6只，分別于8:00和20:00灌胃給予纈沙坦。以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配成含纈沙坦1.6 mg/mL混懸液，給藥體積10 mL/kg。于給藥前及給藥后0.33、0.67、1、2、4、8、12、24 h由眼內(nèi)眥靜脈采血0.5 mL，置1.5 mL抗凝離心管中，12 000 r/min離心 10 min，取上層血漿，－70℃冰箱保存?zhèn)溆?，HPLC測定血漿纈沙坦?jié)舛取?/p>

3.4 血漿樣本處理

精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液40 μL，置2 mL離心管中，氮?dú)獯蹈?。加入血漿（空白或含藥血漿）200 μL，乙腈600 μL，振蕩3 min，12 000 r/min離心10 min。取上清液200 μL，12 000 r/min離心10 min，取上清液30 μL進(jìn)樣分析。

3.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用Drug And Statistics of Windows 2.1（DAS2.1）軟件一室開放模型及統(tǒng)計(jì)矩法分析藥動學(xué)特征并求算參數(shù)；采用SPSS Statistics17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 結(jié)果

4.1 專屬性

取 6份不同來源大鼠血漿，按 3.4項(xiàng)下方法處理，所得色譜圖（圖1）顯示纈沙坦保留時間約17.87 min，內(nèi)標(biāo)保留時間約13.03 min。纈沙坦與內(nèi)標(biāo)分離完全，峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。證明方法專屬性高，測得結(jié)果為纈沙坦實(shí)際濃度。

圖1 纈沙坦血漿濃度的HPLC圖A：空白血漿；B：纈沙坦及內(nèi)標(biāo)血漿；C：纈沙坦用藥血漿

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取不同濃度的纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入內(nèi)標(biāo)和空白血漿，配制成 80、40、16、8、4、1.6、0.8和0.4 μg/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按3.4項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行色譜分析。以纈沙坦對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）對濃度（C，μg/mL）作線性計(jì)算，得方程

線性范圍0.4～80 μg/mL。血漿纈沙坦最低定量限為0.5 μg/mL。

4.3 回收率

取濃度為0.8、8和40 μg/mL的纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，制成濃度為0.8、8和40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)纈沙坦含藥血漿溶液，每濃度各5份，按3.4項(xiàng)下方法操作，取30 μL進(jìn)樣分析。分別記錄血漿樣本及標(biāo)準(zhǔn)溶液的纈沙坦色譜峰面積A1及A2，以A1/A2×100%計(jì)算回收率為（70.29±5.09）%、（75.90±1.60）%及（68.13±2.12）%，見表1。

表1 血漿纈沙坦提取回收率（n=5）

4.4 精密度與準(zhǔn)確度

配制低、中、高三個濃度為0.8、8和40 μg/mL的纈沙坦含藥血漿并繪制相應(yīng)隨行曲線，每批每濃度各5份及1條隨行曲線，3.4項(xiàng)下方法操作后進(jìn)行色譜分析，考察纈沙坦的日內(nèi)、日間精密度和方法回收率（表2）。

表2 血漿纈沙坦測定的精密度與準(zhǔn)確度（±s，n=5）

表2 血漿纈沙坦測定的精密度與準(zhǔn)確度（±s，n=5）

組內(nèi)比較 組間比較含藥血漿濃度（μg/mL）RSD（%）0.8 0.76±0.03 0.75±0.01 1.82 93.37 8 6.76±0.16 6.70±0.06 0.91 82.50 40 35.78±0.18 35.65±0.42 1.17 88.88實(shí)測濃度（μg/mL）RSD（%）3.55 2.42 0.49實(shí)測濃度（μg/mL）準(zhǔn)確度（%）

4.5 定量下限

取纈沙坦?jié)舛葹?0.4 μg/mL的空白血漿（纈沙坦含藥血漿），平行5份測定，由隨行曲線求算纈沙坦?jié)舛葹椋?.32±0.01）μg/mL，見表3。

表3 血漿纈沙坦定量下限（n=5）

4.6 穩(wěn)定性

取0.8、8和40 μg/mL的纈沙坦含藥血漿，分別置室溫12 h、進(jìn)樣器內(nèi)8 h，－70℃冰箱凍融3次，各條件同一濃度平行處理3份測定，由隨行曲線測得準(zhǔn)確度為80.9%～95.3%，說明樣本穩(wěn)定，符合生物樣本分析要求（表4）。

表4 血漿纈沙坦穩(wěn)定性（±s，n=5）

表4 血漿纈沙坦穩(wěn)定性（±s，n=5）

含藥血漿濃度（μg/mL）實(shí)測濃度（μg/mL)直接處理 置進(jìn)樣器內(nèi)8 h置室溫12 h 凍融3次0.8 0.66±0.04 0.69±0.05 0.60±0.02 0.54±0.01 8 7.36±0.16 7.46±0.27 7.20±0.15 7.10±0.24 40 36.86±0.91 35.95±0.56 38.04±0.77 36.83±0.65

4.7 藥動學(xué)研究

晝（8:00）、夜（20:00）不同時間，單劑量灌胃給予纈沙坦（16 mg/kg）后，纈沙坦在大鼠體內(nèi)血藥濃度有較大差異（P＜0.05），見圖2、表5。提示用藥時間不同對纈沙坦在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)有一定影響。白晝用藥的 Cmax顯著升高（P＜ 0.05）但藥物-時間曲線下面積（AUC）差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 用藥時間對纈沙坦?jié)舛龋–）-時間（t）曲線影響（±s，n=6）

表5 纈沙坦在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（x±s，n=6）

各組動物的藥動學(xué)主要參數(shù)見表5。結(jié)果表明，用藥時間不同，對纈沙坦的藥動學(xué)也有很大影響。20:00用藥較8:00用藥使得纈沙坦平均滯留時間（MRT）及 t1/2延長（P＜ 0.05或 P＜ 0.01），而表觀分布容積（Vd）顯著增大（P＜0.05）。

5 討論

5.1 血藥濃度測定方法

本研究采用文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的 HPLC紫外分析法，檢測纈沙坦血藥濃度，并對該方法作了一定優(yōu)化改進(jìn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，流動相取乙腈與甲醇比例為7∶3時，樣本和內(nèi)標(biāo)的保留時間更為適宜，檢測波長定為237 nm，可獲得良好的吸收峰。血漿樣本預(yù)處理中的蛋白沉淀，一般采用加入高氯酸、三氟乙酸等方法。鑒于此類物質(zhì)具強(qiáng)氧化性，可能會導(dǎo)致纈沙坦和內(nèi)標(biāo)氧化破壞，且強(qiáng)酸性可能損傷色譜柱。本研究在比較多種蛋白沉淀方法后證實(shí)，以加入3倍體積乙腈的方法，蛋白沉淀最為完全，提取回收率高，重現(xiàn)性好，血漿中雜質(zhì)不干擾藥物測定。表明該方法符合生物樣本的分析要求，可以用于血漿纈沙坦?jié)舛葴y定及臨床藥動學(xué)研究。

5.2 擇時用藥對纈沙坦藥動學(xué)的影響

纈沙坦單劑量（16 mg/kg）灌胃給藥，大鼠體內(nèi)C-t曲線呈一室模型。以8:00用藥組為例，用藥后約 2 h Cmax達(dá)（17.02± 3.65）mg/L，t1/2（6.45± 1.74）h，結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報(bào)告值相似。晝夜不同時間用藥，尚可影響纈沙坦的其他藥動學(xué)參數(shù)。20:00用藥組可使纈沙坦t1/2及MRT顯著延長 （P＜0.05或P＜0.01）。已知纈沙坦主要以原形經(jīng)膽汁及尿液排泄[11]，時間生物學(xué)研究證實(shí)，人及大鼠腎排泄功能呈晝夜波動，在活動期腎功能較高，尿量較多[12-13]，大鼠為夜行性動物，夜間腎功能高于白晝，且大鼠于夜間的攝食、飲水量約占全天攝入量的80%以上[14]。大鼠腎功能、尿量及膽汁分泌的晝夜差異可能是引起纈沙坦排泄晝夜差異的主要原因。對8:00用藥組，在進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測的24 h內(nèi)，前半段為動物休息期，此時血漿蛋白水平較低、藥物排泄較慢，因此血藥濃度較高；而后半段消除相為動物活動期，此時血漿蛋白水平較高，藥物排泄較快，t1/2較短。20:00用藥組情況則恰好相反，呈血藥濃度較低，t1/2較長的趨勢。結(jié)果表明晝夜不同時間用藥對大鼠纈沙坦藥動學(xué)有一定影響，本研究為臨床擇時使用纈沙坦提供參考，臨床應(yīng)選擇何時用藥尚需進(jìn)一步研究。

[1] 黎春輝.抗高血壓藥物治療中不合理用藥案例分析[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2010，7（1）：6-8.

[2] 楊赴云.ACEI和ARB治療原發(fā)性高血壓的療效比較[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2009，6（6）：42-44.

[3] Nishimura T，Hashimoto J，Ohkubo T，et al.Efficacy and duration of action of the four selective angiotensinⅡ subtype 1 receptor blockers，losartan，candesartan，valsartan and telmisartan，in patients with essential hypertension determined by home blood pressure measurements[J].Clin Exp Hypertens，2005，27（6）：477-489.

[4] 劉曉云，宋建國.抗高血壓單片復(fù)方制劑纈沙坦/氨氯地平臨床藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2011，8（1）：31-36.

[5] 何寶時.纈沙坦在人體的藥物動力學(xué)分析[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4（11）：149-150.

[6] Kaneshiro Y，Ichihara A，Sakoda M，et al.Add-on benefits of amLodipine and thiazide in nondiabetic chronic kidney disease stage1/2patientstreatedwithvalsartan[J].KidneyBloodPressRes，2009，32（1)：51-58.

[7] 霍強(qiáng)，楊敏，吳華璞，等.纈沙坦分散片人體生物等效性研究[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，33（3）：347-349.

[8] 李揚(yáng)，陳今揚(yáng)，王德志，等.高效液相色譜法測定人血漿中纈沙坦、氫氯噻嗪濃度[J].中國新藥雜志，2005，14（11）：1335-1338.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2005版）二部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄152-156.

[10] Asmar R，Gosse P，Queré S，et al.Efficacy of morning and evening dosing of amlodipine/valsartan combination in hypertensive patients uncontrolled by 5 mg of amlodipine[J].Blood Presse Monit，2011，16（2)：80-86.

[11] 許金紅，劉曉云，宋建國.高血壓的時間治療用藥方案[J].實(shí)用藥物與臨床，2012，15（1）：54-56.

[12] 周天祿.生理機(jī)能的時間節(jié)律.時間藥理學(xué)與時間治療學(xué)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1994：48.

[13] 趙玉玲，戴倫，李國臣，等.抑制血壓晨峰的方法[J].中華高血壓雜志，2009（2）：104-106.

[14] Ofili EO，Oparil S，Giles T，et al.Moderate versus intensive treatment of hypertension using amlodipine/valsartan and with the addition of hydrochlorothiazide for patients uncontrolled on angiotensin receptor blocker monotherapy：results in racial/ethnic subgroups[J].J Am Soc Hypertens，2011，5（4）：249-258.

Concentration Determination of Valsartan in Rat Plasma by HPLC and its Pharmacokinetics Study

Xu Jinhong1，Song Jianguo2，Li Yongxia1
（1 Pharmacy Department of the PLA Navy Anqing Hospital，Anhui Anqing 246003，China；2 Department of Pharmacology of Wannan Medical College，Anhui Wuhu 241002）

Objective:To establish an method for the determination of the concentration of valsartan in rats plasma by HPLC and to study its pharmacokinetics so as to provide useful information for clinical practice.Methods:Twelve male SD rats were divided into two groups randomly，and a single dose of valsartan （16 mg/kg）was administered intragastrically at either 8:00 or 20:00 respectively.Plasma samples were collected at 0，0.33，0.67，1，2，4，8，12 and 24 h after the drug administration.A HPLC with UV detection method was developed to determine the concentration of valsartan in rats plasma.Results:The results showed that valsartan plasma concentration-time（C-t）curves in rats were fitted by one-compartment model with tmax=2 h and t1/2=（6.45±1.74）h（dosing at 8:00）.There were lower Cmax（P＜0.05），longer t1/2（P＜0.05）and mean retention time （MRT） （P＜0.01）in rats when administrated at 20:00 compared with those of dosing at 8:00. Conclusion:This method is simple with high sensitivity and good precision and is proved to be suitable for the pharmacokinetic study of valsartan.The blood concentration of valsartan was higher and t1/2was shorter when dosing at 8:00 than those at 20:00.The administration of valsartan at different times of a day showed a certain effect on the pharmacokinetics of valsartan.

HPLC；Valsartan；Blood Concentration；Circadian Rhythm；Pharmacokinetics；Experimental Research

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.03.005

2012-08-16）

許金紅，女，碩士，藥師。研究方向：臨床藥學(xué)和定量藥理學(xué)。E-mail：xujinhon_2006@126.com

宋建國，男，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向：定量藥理學(xué)和時間藥理學(xué)。通訊作者E-mail：sjg68755356@163.com