王智慧， 楊 帥， 劉宏民

(鄭州大學藥學院 河南 鄭州450001)

0 引言

紅霉素(erythromycin)是紅霉素鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物，為十四元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素．它的抗菌譜和青霉素相似，特別是對革蘭氏陽性細菌、抗酸桿菌、立克次氏體及大病毒有抗菌活性，是治療溶血性鏈球菌和耐藥性金黃色葡萄球菌感染所引起疾病的首選藥物，同時紅霉素類衍生物的生產(chǎn)應用進一步刺激了對母體紅霉素的需求［1］．影響紅霉素發(fā)酵的主要因素是菌種的質(zhì)量，其優(yōu)劣對紅霉素發(fā)酵工業(yè)有極大的影響［2］．目前我國紅霉素的發(fā)酵工業(yè)與國外相比還有較大的差距，作者擬通過對紅霉素生產(chǎn)菌種的改良，通過氯化鋰、紫外和微波的復合誘變，以達到提高紅霉素發(fā)酵效價，降低紅霉素生產(chǎn)成本，增強我國紅霉素的國際市場競爭能力的目的．

1 材料與方法

1．1 菌種

紅霉素生產(chǎn)菌株為紅霉素鏈霉菌(Streptomyces erythreus)．

1．2 培養(yǎng)基

斜面、平板與茄子瓶培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉10，硫酸銨3，蛋白胨10，玉米漿12，氯化鈉3，碳酸鈣3，瓊脂粉20～22;pH 7．0～7．2．搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉25，黃豆餅粉18，玉米漿13，蛋白胨5，糊精25，葡萄糖10，氯化鈉 4，碳酸鈣8，硫酸鎂0．25，磷酸二氫鉀0．2，硫酸銨 12;豆油 0．4 mL/50 mL，pH 7．0 ～7．2．搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):黃豆餅粉30，可溶性淀粉45，正丙醇10，糊精5，硫酸銨3，氯化鈉3，碳酸鈣4，葡萄糖10，硫酸鎂 1．2，磷酸二氫鉀 0．2;豆油 0．4 mL/50 mL，pH 6．8．

1．3 培養(yǎng)條件

斜面、平板與茄子瓶培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度34℃，相對濕度50%，培養(yǎng)時間8～9 d．搖瓶種子液培養(yǎng)條件:取兩株經(jīng)過活化的菌種，接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，培養(yǎng)溫度32℃，相對濕度40% ～60%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時間3～5 d．搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件:搖瓶裝量50 mL/250 mL，接種量10%，32℃培養(yǎng)，相對濕度40% ～60%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時間6～7 d［3］．

1．4 誘變及篩選方法

1．4．1 單孢子懸液的制備 成熟的新鮮斜面加入10 mL無菌水，將培養(yǎng)好的新鮮斜面孢子刮洗下來裝入帶有玻璃珠的500 mL三角瓶內(nèi)，220 r/min振搖20 min，過濾成菌懸液備用．

1．4．2 紫外誘變 將制備好的孢子懸液用生理鹽水依次稀釋，采用血細胞計數(shù)板計數(shù)，得到孢子數(shù)約在100～1 000個/mL的菌懸液．取10 mL菌懸液至9 cm培養(yǎng)皿中，在用磁力攪拌器攪拌的同時，于15 W紫外燈(λ =253．7 nm)，距離30 cm 條件下照射0，15，30，45，60 s．然后涂布于種子培養(yǎng)基上，放入34℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d．

1．4．3 氯化鋰誘變 用移液器吸取0．1 mL孢子懸液于氯化鋰質(zhì)量濃度依次為0，2，4，8，10 mg/L的梯度培養(yǎng)皿中進行涂布，放入34℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d．

1．4．4 微波誘變 吸取制得的孢子懸液，注入底部平整的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿的懸液量為10 mL，調(diào)微波爐功率為700 W，脈沖頻率為2 450 MHz，處理時間分別為0，15，30，45，60 s．然后從每個培養(yǎng)皿中取出0．1 mL菌懸液，分別用0．85%生理鹽水梯度稀釋，稀釋梯度為10－2～10－7，得到不同稀釋梯度的菌懸液．取稀釋后的菌懸液0．1 mL涂布于培養(yǎng)皿，放入34℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d［4］．

1．4．5 氯化鋰－紫外－微波復合誘變 將制得的孢子懸液先涂布于氯化鋰平板培養(yǎng)基上，在紫外燈下照射一段時間后進行培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)基放入微波爐選擇合適時間進行誘變．從每個培養(yǎng)皿中取出0．1 mL菌懸液，分別用0．85%生理鹽水稀釋，稀釋梯度為10－1～10－7，得到不同稀釋濃度的菌懸液．吸取稀釋后的菌懸液0．3 mL，涂布分離培養(yǎng)基平板，然后置于34℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，活菌計數(shù)，計算致死率．

1．4．6 效價測定 精確稱取樣品10～12 mg于表面皿中，加乙醇(10 mg加入1 mL乙醇)后，加水稀釋為1 000 μg/mL 的紅霉素標準液．吸取 0．4、0．8、1．2、1．6、2．0 mL 于分液漏斗中，加入 0．35%碳酸鉀溶液稀釋至20 mL，再加入醋酸丁酯20 mL，混勻1 min，靜置分層．吸取上層液體10 mL于另一個干燥分液漏斗中，準確加入0．1 mol/L HCl 10 mL，震蕩30 s，靜置分層．取下層溶液5 mL于另一個試管中，加入8 mol/L硫酸溶液5 mL，搖勻，于50℃水浴30 min，然后取出冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，使用721型分光光度計于483 nm波長處進行比色，可得化學效價=23 247A483+864．97．

1．4．7 篩選方法 從培養(yǎng)成熟的菌落中挑選正常型菌落接斜面，待生長成熟后按10%的接種量接入搖瓶進行培養(yǎng)，測定紅霉素的產(chǎn)率及組分．

1．5 統(tǒng)計學分析

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用x±s表示，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學意義．

2 實驗結(jié)果

2．1 紫外誘變

從經(jīng)紫外線照射的每個劑量的平板中各挑選20株紅霉素菌種進行搖瓶實驗，考察紫外線照射時間對紅霉素菌種正突變率的影響．結(jié)果如圖1所示，菌種的致死率隨著紫外線照射時間的延長而增加，45 s時致死率已經(jīng)達到90．2%，此時正突變率為30．5%．60 s時菌株的正突變率為30%，而且菌株基本已經(jīng)全部死亡．因此本實驗確定45 s為紫外線最佳照射時間．

2．2 氯化鋰誘變

氯化鋰處理后的紅霉素鏈霉菌隨著氯化鋰質(zhì)量濃度的升高，致死率逐漸變大，同時正突變率出現(xiàn)了先增后減的趨勢(圖2)．當氯化鋰質(zhì)量濃度達到4 mg/L時，鏈霉菌株的致死率是36．2%，此時正突變率最高，為15．2%．因此本實驗確定4 mg/L為最佳氯化鋰誘變劑量．

2．3 微波誘變

本實驗所選用微波爐的最大功率為700 W，因此選用最大功率700 W進行誘變，實驗中使用冰浴降溫以消除由于微波所產(chǎn)生的熱效應．由圖3可知，微波照射的紅霉素鏈霉菌隨時間的延長，致死率逐漸上升，而且在幾個實驗組中菌株致死率都在75%以上．當微波照射時間選擇30 s時菌株的正突變率最高，為14．3%．因此本實驗確定30 s為最佳微波照射時間．

圖1 紫外誘變Fig．1 UV mutagenesis

圖2 氯化鋰誘變Fig．2 LiCl mutagenesis

2．4 復合誘變

按照優(yōu)化的實驗條件，即氯化鋰的質(zhì)量濃度為4 mg/L，紫外誘變45 s，微波誘變30 s，選擇在最優(yōu)條件下復合誘變后的正突變菌株各100株進行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如表1所示．復合誘變的致死率最高，為(92．2 ±2．8)%，正突變率也為最高的(40．6 ±2．2)%．說明復合誘變效果比單一誘變要好．將復合誘變出來的菌株再進行多次復合誘變，最終篩選出紅霉素高產(chǎn)菌株，命名為W-12．圖4所示為誘變菌株在培養(yǎng)皿中生長的單菌落．

圖3 微波誘變Fig．3 Microwave mutagenesis

2．5 紅霉素高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性實驗

將初始菌株和高產(chǎn)菌株W-12斜面?zhèn)鞔?，各傳?次，每代3個平行樣本，然后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)168 h．發(fā)酵完成后進行效價測定，取3個值的平均值考察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性．結(jié)果表明，該菌株具有良好的傳代穩(wěn)定性，遺傳穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表2．由表2可知，紅霉素鏈霉菌菌株經(jīng)過紫外、氯化鋰、微波復合誘變后，抗生素效價最高達6 432 μg/mL，比初始菌株效價提高了11%．

表1 各種誘變結(jié)果的比較Tab．1 Comparison of various mutagenesis results

圖4 紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株Fig．4 High-producing strain of Streptomyces erythreus

表2 紅霉素鏈霉菌菌株遺傳穩(wěn)定性數(shù)據(jù)Tab．2 Genetic stability data of Streptomyces erythreus strains

3 討論

在試驗和生產(chǎn)中經(jīng)常使用各種誘變方法對工程菌進行誘變以期獲得高產(chǎn)菌株［5］．誘變分為物理誘變和化學誘變:物理誘變主要有紫外線、X射線、γ射線、快中子、激光、微波、離子束等;化學誘變包括烷化劑、天然堿基類似物、氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物和吖啶等嵌入染料［6］．紅霉素的菌種誘變選育一般采用紫外線、激光、快中子、微波等物理手段和氯化鋰、亞硝酸鹽等化學誘變．但是抗生素產(chǎn)生菌經(jīng)過相同誘變處理后，有可能導致突變位點飽和，影響誘變效果，給繼續(xù)提高帶來困難［7］．

紫外線誘變具有方法簡單、效果顯著的優(yōu)點，在抗生素篩選和微生物發(fā)酵過程中應用廣泛．已經(jīng)有很多報道證明紫外線與其他誘變劑進行復合處理，可使紫外線的誘變效果得到提高［8－9］．氯化鋰能夠?qū)е翧T-GC堿基對的轉(zhuǎn)換或?qū)е聣A基的缺失，經(jīng)過前處理進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，吸收紫外的能量后能夠增強紫外線的誘變效應，如文獻［10］報道采用氯化鋰的前處理效果比較好，文獻［11］使用紫外線和氯化鋰復合誘變手段選育出紅霉素高產(chǎn)菌株．

作者使用紫外、氯化鋰和微波3種誘變方法共同篩選紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株，主要考慮到這幾種實驗方法在實驗室容易操作，而且氯化鋰進入細胞內(nèi)通過對順式作用元件作用于DNA，使之形成基因增強子，從而提高紫外和微波的誘變效應［12－13］．實驗結(jié)果也證實復合誘變具有良好的效果，與出發(fā)菌株相比，正突變率達到了40．6%．篩選得到誘變菌株W-12，該菌株效價比初始菌株提高了11%．由于時間關系，尚未對該菌株進行發(fā)酵罐試驗，但是為下一步搖瓶培養(yǎng)基的優(yōu)化奠定了較好的基礎．

［1］ 余俊堂，唐孝宣．新編生物工藝學［M］．北京:化學工業(yè)出版社，2003:110－111．

［2］ 李武德，唐慧慧，萬丹，等．紅霉素高產(chǎn)菌株的篩選［J］．中國抗生素雜志，2009，34(9):541－542．

［3］ 左勇，李楊，任永利，等．紅霉素產(chǎn)生菌的誘變及培養(yǎng)基優(yōu)化研究［J］．四川理工學院學報:自然科學版，2012，25(1):14－18．

［4］ 王筱虹，倪文琴，劉寒．原生質(zhì)體紫外誘變技術篩選紅霉素高產(chǎn)菌株的研究［J］．中國藥科大學學報，2000，31(4):63－65．

［5］ 虞龍，張宇，龔文靜，等．氯化鋰－紫外－離子束復合誘變紅霉素高產(chǎn)菌株研究［J］．原子能科學技術，2011，45(7):780－784．

［6］ 潘淑勇．響應曲面法優(yōu)化柔紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基［J］．中國抗生素雜志，2012，37(11):830－836．

［7］ 杜潤泮，李雪康，葉文忠，等．灰色鏈霉菌快中子誘變育種［J］．復旦學報:自然科學版，1981，20(4):372－376．

［8］ 胡旭曄．多殺菌素產(chǎn)生菌的誘變育種與發(fā)酵工藝研究［D］．上海:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，2006．

［9］ Susan B，Sebastian A．OXAβ-lactamases in acinetobacter:the story so far［J］．Antinicrol Chemother，2006，57(1):1 －3．

［10］O’Hare H M，Baerga-Ortiz A，Popovic B，et al．High-throughput mutagenesis to evaluate models of stereochemical control in ketoreductase domains from the erythromycin polyketide synthase［J］．Chem Biol，2006，13(3):287 － 296．

［11］ Bergogne-Bérézin B，Towner K J．Acinetobacter spp．a(chǎn)s nosocomial pathogens:microbiological，clinical，and epidemiological features［J］．Clin Microbiol Rev，1996，9(2):148 －165．

［12］王園秀，吳曉玉，豐娟．一株產(chǎn)冠菌素新菌種的分離與鑒定［J］．微生物學報，2010，50(1):23－28．

［13］安欣．基于4種抗生素抗性誘變的Xenorhabdus bovienii YL002菌株抑菌活性研究［D］．咸陽:西北農(nóng)林科技大學，2012．