于 萍， 馬 良， 陳小兵， 安麗平， 黃進勇

(鄭州大學生物工程系 河南鄭州450001)

0 引言

白芥是十字花科白芥屬植物，是一種重要的常用中藥材．目前，白芥的研究報道集中在白芥子的主要成分及藥理學研究［1－3］、外界環(huán)境脅迫對其影響的研究［4－6］及白芥與其他油料作物間的體細胞雜交研究［7］等方面，而對白芥基因克隆、基因表達及轉錄組分析等方面的研究鮮有報道．

純度高、完整性好的植物RNA是進行實時熒光定量PCR、Northern印跡及雜交分析、構建cDNA文庫以及基因克隆等分子生物學研究的必要前提．目前，已經(jīng)發(fā)展了包括Trizol法、改良異硫氫酸胍法［8］、CTABLiCl法、CTAB-異丙醇法在內的多種總RNA提取技術［9－11］，以及改良過的適用于油料作物種子的RNA提取方法［12］，改良過的CTAB法提取香蕉葉片總 RNA的方法［13］，提取棉花不同組織總 RNA的熱硼酸改良法［14］．但是由于每種RNA提取方法的針對性有所不同，所以用不同的RNA提取方法對同一種植物或動物組織進行提取，得到的結果也不盡相同．白芥中含有大量的油脂、糖類、酚類、蛋白等物質，增加了RNA提取的難度．作者分別采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法、RNAiso Plus法、CTAB-異丙醇法對白芥幼嫩葉片總RNA提取進行了比較研究，以期找到一種既快捷又高效的提取白芥葉片總RNA的最優(yōu)方法，為深入開展白芥抗逆性、基因表達等分子生物學研究奠定基礎，使白芥的藥用價值得到更廣泛的開發(fā)和利用．

1 材料與器材

1．1 材料

白芥種子購于中國中草藥種子公司;白芥幼苗由鄭州大學生物工程系植物生理與生化實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)至白芥長出四片真葉時用于實驗．

1．2 實驗試劑

焦碳酸二乙酯(DEPC)、瓊脂糖、1．5mL RNase/DNase離心管、柱式植物總 RNA抽提純化試劑盒、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit均購自上海生工生物工程公司;白芥黑芥子酶引物由上海生工生物工程公司合成;RNAiso Plus、DL2000 DNA Marker購自大連寶生物(TAKARA)公司;氯仿、異戊醇、異丙醇、75%乙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑．

50×TAE緩沖液:Tris 242 g，乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37．2 g，醋酸57．1 mL，攪拌混勻，調 pH 至8．3(使用時稀釋成1×TAE緩沖液)．

CTAB 提取液:0．1 mol/L Tris-HCl(pH 8．0)，0．05 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，2%十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，20 g/L 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，1．5 mol/L NaCl，0．2%β-巰基乙醇．

RNA提取實驗所用試劑均用0．1%DEPC處理水(放置過夜，高壓滅菌)配制;所用研缽、研棒、藥匙均用0．1%的DEPC水浸泡過夜，120℃滅菌，烘干，放入冰箱預冷，備用．

1．3 實驗儀器

JW-2017HR高速冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司);JY300C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)．

2 實驗方法

2．1 總RNA提取

分別采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法、RNAiso Plus法、CTAB-異丙醇法對白芥幼嫩葉片總RNA進行提取，每種方法重復3次．

2．1．1 試劑盒法 采用上海生工生物工程公司柱式植物總RNA抽提純化試劑盒，參照試劑盒說明進行如下步驟:取450 μL Buffer Rlysis-PG加入1．5 mL RNase-free的離心管中備用．取25～50 mg新鮮白芥葉片用液氮研磨成粉末，加到上述1．5 mL離心管中，立即震蕩混勻，室溫放置5 min．12 000 r/min 4℃離心3 min，將上清移至1．5 mL RNase-free的離心管中．加入1/2體積無水乙醇，充分混勻．將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液全部加至吸附柱中，靜置1 min，室溫12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中廢液．將吸附柱放回收集管中，加入500 μL GT溶液，靜置1 min，室溫10 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中廢液．將吸附柱放回收集管中，加入500 μL NT溶液，靜置1 min，室溫10 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中廢液．將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min離心2 min．將吸附柱放入RNase-free的1．5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 μL RNase-free水，靜置2 min，12 000 r/min離心2 min，將所得到的RNA溶液置于－70℃保存或用于后續(xù)實驗．

2．1．2 RNAiso Plus法 實驗步驟如下:向1．5mL RNase/DNase的離心管中加入1．0 mL RNAiso Plus．將新鮮的白芥葉片放入預冷的研缽中，加入液氮研磨，其間不斷加入液氮，直至研成粉末，迅速轉移50～100 mg粉末于已加入有RNAiso Plus裂解液的離心管中，并充分振蕩使樣品混勻．室溫靜置5 min(根據(jù)所選材料需要改為7 min)，12 000 r/min 4℃離心5 min，小心吸取上清液，移入新的離心管中．加入RNAiso Plus的1/5體積量氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈震蕩15 s．待溶液充分乳化后，室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，此時溶液分為3層．小心吸取上清液，移入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，15～30℃下靜置10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，出現(xiàn)沉淀．小心棄去上清，緩慢沿離心管壁加入1 mL 75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12 000 r/min 4℃離心5 min，小心棄去乙醇(盡量除盡乙醇)．室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后用于后續(xù)實驗，或保存在－80℃冰箱．

2．1．3 CTAB-異丙醇法 實驗操作步驟參照宋暉等［15］的方法進行．

2．2 總RNA完整性及純度檢測

2．2．1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 分別取得到的RNA樣品6 μL，點樣于1．0%非變性瓊脂糖凝膠中進行電泳實驗，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察其完整性．

2．2．2 紫外分光光度計檢測 用TE溶液作空白對照，然后將提取到的RNA稀釋50倍，分別在260 nm和280 nm測定吸光度，計算A260/A280比值及各RNA的質量濃度．

2．2．3 反轉錄RT-PCR 采用3種不同方法提取出的RNA作為模板，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的說明添加反轉錄反應體系，合成第一條鏈cDNA．以此cDNA為模板，白芥黑芥子酶上游引物P1(5’-GATTGGACCTGTGATGATAAC-3’)、下游引物 P2(5’-TTGGCTTGGCATACTGAG-3’)進行黑芥子酶基因的 PCR 擴增．PCR 反應體系為:cDNA 2 μL，上游引物 P10．5 μL，下游引物 P20．5 μL，Taq Mix 12．5 μL，加水至25 μL反應體系進行PCR擴增反應．PCR反應程序:首先94℃預變性3 min，然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，這3個過程循環(huán)35次，最后再72℃延伸5 min，4℃保溫．PCR產(chǎn)物用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，拍照保存．

3 結果與分析

3．1 不同方法對白芥葉片總RNA提取的完整性檢測

如圖1所示，柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法、RNAiso Plus法和CTAB-異丙醇法都能從白芥葉片中提取得到不同產(chǎn)率、不同純度的總RNA．柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法提取得到的RNA，28S rRNA和18S rRNA條帶不明顯，幾乎看不到5S rRNA，有可能在使用試劑盒提取過程中，使用吸附柱洗脫雜質時部分RNA隨著雜質一起被洗脫，導致總RNA的產(chǎn)率損失很大;CTAB-異丙醇法提取的白芥葉片總RNA中，28S rRNA和18S rRNA條帶完整，但有一定程度的彌散，且在點樣孔周圍及下方有明顯的殘留，說明該方法提取的RNA有降解且有基因組DNA或蛋白的污染;而用RNAiso Plus法提取的白芥葉片總RNA中，28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA帶型清晰，且條帶無彌散現(xiàn)象，說明該方法提取的白芥葉片總RNA完整性好、無降解．

3．2 紫外分光光度計檢測

高純度的RNA的A260/A280比值應該在1．9～2．1之間．如表1所示，與RNAiso Plus法相比，柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法得到的RNA的A260、A280有極顯著的降低，CTAB-異丙醇法得到的RNA的A260、A280有極顯著的升高(P＜0．01);與RNAiso Plus法相比，柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法得到的RNA的A260/A280比值有極顯著的升高(P＜0．01)，CTAB-異丙醇法得到的RNA的A260/A280比值有極顯著的降低(P＜0．01);但柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法的產(chǎn)率不高，平均質量濃度為143．3 ng/μL，RNAiso Plus法平均質量濃度為 230．6 ng/μL，CTAB-異丙醇法平均質量濃度為 257．0 ng/μL．

圖1 3種不同方法提取出的白芥葉片總RNA電泳圖Fig．1 Electrophoresis results for total RNA extraction from Sinapis alba leaves with three different methods

表1 3種不同方法提取出的白芥葉片總RNA純度及其質量濃度Tab．1 Purity and mass concentration of total RNA extraction from Sinapis alba leaves with three different methods

3．3 RT-PCR擴增檢測

分別以各RNA反轉錄的cDNA為模板，均擴增出了長度為250 bp的目的條帶，RT-PCR擴增結果如圖2所示．除CTAB-異丙醇法中的7～9條帶有輕微的彌散外，其余的條帶都清晰明亮，且穩(wěn)定性好．表明除CTAB-異丙醇法外，另兩種方法提取的總RNA反轉錄后的cDNA樣品，可用于基因克隆、基因表達等分子生物學研究［16］．

4 討論

純度高、完整性好的RNA提取是進行實時熒光定量PCR、Northern印跡及雜交分析及基因克隆等分子生物學研究的必要前提．植物組織總RNA的提取較動物和微生物困難，原因是植物具有堅硬的細胞壁，富含多種次生代謝物．細胞破碎后，這些物質將以不同方式干擾RNA的提?。c其他植物相比，白芥葉片中含有酚類、糖類、蛋白等大分子物質，當研磨使細胞破碎時，這些大分子物質與RNA相互作用，影響RNA的分離純化．

RNA酶是導致RNA降解的最主要物質，其生物活性非常穩(wěn)定，并且分布廣泛，除細胞內源性的RNA酶外，環(huán)境中的灰塵、各種試驗器皿和試劑、人體的汗液以及唾液中均存在RNA酶．因此，在提取RNA的過程中最關鍵的因素是盡量減少RNA酶的污染，控制RNA酶對RNA的降解作用，通過高溫烘干、戴口罩和經(jīng)常更換手套等途徑去除外源性RNA酶的污染，用DEPC處理水配制各種溶液及使用變性劑(如β-巰基乙醇)等抑制內源性RNA酶的活力．

在眾多提取方法中，針對不同的植物材料，要選擇不同的提取方法，才能取得較好的提取效果［17］．現(xiàn)在已有許多公司根據(jù)科研需要研制出一些總RNA提取試劑及試劑盒，其中部分試劑盒對一些植物進行提取也能得到較好的提取效果［15］，但由于大量提取RNA的成本太高，極少被采用．本研究中采用的柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法提取白芥總RNA，充分研磨使細胞破碎后，RNA易與植物組織中的糖類、酚類等黏附在一起，使用吸附柱去除多糖、酚類等雜質時，部分RNA可能被一起去除，導致該方法提取的RNA產(chǎn)率較低，所以不予采用此方法．CTAB抽提法被廣泛應用于植物DNA和RNA的提取．CTAB是一種很強的去污劑，有明顯的蛋白質變性效果．CTAB法已成功地從棗［18］、香蕉［13］等富含多糖、多酚的植物組織中提取到高質量的RNA，并且CTAB法提取緩沖液中的PVP具有很強的結合多酚化合物的能力．但不同植物物種的理化性質不同，同一方法不一定對所有植物適用．本研究采用CTAB-異丙醇法對白芥葉片進行總RNA提取，由于白芥中蛋白含量較高，如圖1(7～9)所示，該方法提取的總RNA純度不高，且提取時間較長，RNA很容易在提取過程中分解，提取結束后需要進行去除RNA樣品中DNA污染的操作．

RNAiso Plus法提取時，當加入有機溶劑氯仿后，使多糖、蛋白形成沉淀，與RNA提取液分離，再通過異丙醇洗滌使RNA沉淀，最后用75%酒精進一步洗凈雜質，所以該方法得到的RNA純度和濃度都較高．本研究使用RNAiso Plus法進一步對白芥根尖組織進行總RNA的提取，因白芥根尖中蛋白、酚類等物質含量較低，結果同圖1(4～6)所示，此方法提取出的白芥根尖總RNA條帶清晰，因此RNAiso Plus法適合用于白芥組織總RNA的提取．在提取的白芥葉片總RNA中，柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法、RNAiso Plus法和CTAB-異丙醇法這3種方法中，只有RNAiso Plus法提取得到的RNA純度高、完整性好，適合用于后續(xù)研究．因此，RNAiso Plus法適合用于白芥葉片總RNA的提?。?/p>

圖2 3種不同方法提取出的白芥葉片總RNA的RT-PCR擴增結果Fig．2 RT-PCR results for total RNA extraction from Sinapis alba leaves with three different methods

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