王芳 ，高正良，周本國(guó)，許大鳳，安夢(mèng)楠，吳元華

1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng)市東陵路120號(hào) 110161；

2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，煙草所，合肥市農(nóng)科南路40號(hào) 230031

測(cè)定馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）基因組全序列是了解PVY生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)，對(duì)于研究該病毒的蛋白功能、致病性及對(duì)煙草生產(chǎn)均具有重要意義。陳炯等對(duì)已知全序列的馬鈴薯Y病毒編碼的多聚蛋白氨基酸序列作多重序列分析后，設(shè)計(jì)并篩選出特異性PCR簡(jiǎn)并引物，初步建立了基因組全序列的PCR和RACE技術(shù)快速擴(kuò)增方法，并成功應(yīng)用該方法擴(kuò)增了5個(gè)基因組全序列未知的馬鈴薯Y病毒屬病毒的基因組全序列[1]。國(guó)外已報(bào)道了PVY不同株系的全序列[2]。國(guó)內(nèi)對(duì)一些中國(guó)分離物的分子特性也進(jìn)行了研究，測(cè)定了分離物Guiding-3、HC-2 quan、WA-13 quan等分離物的全序列（GenBank登錄號(hào)：HM590405、HM590406、 HM59040711。但關(guān)于煙草上目前國(guó)際上沒有統(tǒng)一的PVY病毒株系的劃分方法，常用的是鑒別寄主癥狀反應(yīng)和序列分析，或者兩者結(jié)合的方法來(lái)劃分和鑒定PVY株系。隨著種植品種、種植條件、氣候條件的改變，病毒株系易出現(xiàn)變異和重組現(xiàn)象，報(bào)道的病毒重組株系有PVYNTN、PVYNW（在北美被稱為PVYN:O）、PVYNNP株系[3-4]。本文對(duì)PVY遼寧分離物PVY-LN進(jìn)行了全序列測(cè)定，并對(duì)所得的序列推導(dǎo)出的多聚蛋白氨基酸序列做系統(tǒng)進(jìn)化樹以鑒定病毒株系，同時(shí)采用RDP序列重組分析軟件包對(duì)所得序列進(jìn)行了重組分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 毒源

從煙草脈壞死病煙株上分離純化的馬鈴薯Y病毒脈壞死株系遼寧分離物（Potato virus Y— vein necrosis strain Liaoning isolate, PVYN-LN）繁殖保存在普通煙NC89上。

1.2 方法

1.2.1 引物

利用Sequencher 5.0 軟件對(duì)GenBank中已有的PVY全序列進(jìn)行序列比對(duì)，選擇病毒序列最為保守的區(qū)域利用Oligo 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）合成。

表1 PVY全長(zhǎng)擴(kuò)增特異性引物

1.2.2 植物RNA提取

使用TaKaRa RNAiso Plus提取植物的Total RNA，對(duì)提取的RNA進(jìn)行DNase I處理，使用DNase I（RNase Free）（TaKaRa），操作完全按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄

使用TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RT-PCR Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立M-MLV（-）對(duì)照。操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增

使用TaKaRa PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase，取2 μL以上步反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，10 μL 5 ×PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+Plus)，4 μL dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L)，1 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μL)，1 μL 引 物 F830/ R2678、F5711/ R7713、F7442/ R8940、PVY1F/ PVY3R，31 μL dH2O，總體系50 μL。然后進(jìn)行以下反應(yīng)：98℃，10 s；50℃，15 s；68℃，10 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

以PVY1F/ PVY3R PCR產(chǎn)物為模板， PVY1F/R2743、F1810/ R5868、F5711/ PVY3R分別為引物進(jìn)行2nd PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系及條件同上，PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 3’RACE

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0合成cDNA，同時(shí)設(shè)立M-MLV（-）對(duì)照（即不加反轉(zhuǎn)錄酶）。操作參照說(shuō)明書。

以上步反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和TaKaRa LA Taq ? with GC Buffer，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取2 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，8 μL 1× cDNA Dilution Buffer II，1 μL F1 Primer（20 μmol/L），2μL 3′ RACE Outer Primer（10 μmol/L），25 μL 2×GC Buffer I，0.5μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），11.5 μL dH2O， 總 體系50 μL。進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30個(gè)循環(huán)。取 5 μL 進(jìn)行3% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 5’RACE

使用TaKaRa 5′-Full RACE Kit對(duì)總 RNA進(jìn)行“去帽子”反應(yīng)，并與5′RACE Adaptor連接后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)設(shè)立M-MLV（-）對(duì)照。操作參照說(shuō)明書。

使用TaKaRa LA Taq，進(jìn)行1st PCR擴(kuò)增。取2 μL上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，8 μL 1×cDNA Dilution Buffer II ，1 μL R1 Primer（20μmol/L），2 μL 5 ′ RACE Outer Primer（10 μmol/L），25 μL 2×GC Buffer I ，0.5 μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），11.5 μL dH2O ，總體系 50 μL 。于 94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30個(gè)循環(huán)。以上述1st PCR產(chǎn)物為模板，R2為Inner PCR引物進(jìn)行2nd PCR擴(kuò)增。取1 μL 1st PCR反應(yīng)液，8 μL dNTP（2.5 mmol/L each），1 μL CTE867-R2 Primer（20 μmol/L），2 μL 5 ′ RACE Inner Primer（10 μmol/L），25 μL 2×GC Buffer I ，0.5 μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），11.5 μL dH2O ，總體系 50 μL 。于 94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)。取5 μL進(jìn)行3 %瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.7 PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fi cation Kit Ver.2.0切膠回收上述PCR產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 PVY PCR擴(kuò)增

以引物 F830/ R2678、F5711/ R7713、F7442/ R8940、PVY1F/ PVY3R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳結(jié)果如下：

圖1 一步PCR電泳圖譜

以 PVY1F/ PVY3R PCR產(chǎn)物為模板， PVY1F/R2743、F1810/ R5868、F5711/ PVY3R 分別為引物進(jìn)行2nd PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系及條件同上，PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下:

圖2 二步PCR電泳圖譜

2.2 產(chǎn)物純化與測(cè)序

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切膠回收上述PCR產(chǎn)物的主帶，測(cè)序得到病毒序列9079 bp。

2.3 3’RACE

以病毒Total RNA為模板，已獲得的約9K的序列為依據(jù)，對(duì)病毒進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增。分析3′RACE PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果, 3′RACE已經(jīng)得到poly(A)尾，獲取未知序列約594 bp。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下:

圖3 3’RACE一步PCR電泳圖譜

2.4 5’RACE

以病毒Total RNA為模板，以獲得的約9K的序列為依據(jù)，對(duì)病毒進(jìn)行5′RACE擴(kuò)增。分析5′RACE測(cè)序結(jié)果, 5′RACE已經(jīng)獲取未知序列約29 bp。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下:

圖4 5’RACE一步和二步PCR電泳圖譜

2.5 序列測(cè)定與分析

對(duì)PVYN-LN分離物的PCR相應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后直接進(jìn)行序列測(cè)定。利用Sequencher 5.0軟件對(duì)所測(cè)的序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PVYN-LN分離物全基因組序列（NCBI登錄號(hào)為JQ971975）共由9714個(gè)堿基組成（含Poly A尾），整條序列僅包含一個(gè)由9186個(gè)堿基組成的開放讀碼框（ORF），可編碼一條包含3061個(gè)氨基酸的多聚蛋白。

對(duì)PVYN-LN全序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，PVYN-LN與PVY不同株系代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖5）表明，該病毒與在 GenBank 中登錄PVY病毒存在一定相似性，PVYN-LN與其他PVY病毒氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，PVYN-LN與DQ157180氨基酸親緣關(guān)系最近，并與HQ912867、AJ585198、AJ585197、X97895形成一個(gè)分枝，氨基酸分析說(shuō)明PVYN-LN屬于已報(bào)道的PVYN株系。

利用RDP4序列重組分析軟件包對(duì)PVYN-LN進(jìn)行重組分析，發(fā)現(xiàn)所獲全長(zhǎng)序列內(nèi)存在1個(gè)潛在的重組區(qū)域，重組區(qū)域用3種以上方法檢測(cè)(p值選擇0.05)，但檢測(cè)到的重組差異不顯著GENECONV[5](p值 =3.094×10-1)、BOOTSCAN[6](p 值 =1.208×10-2)、MAXCHI[7]（未檢測(cè)出）、CHIMAERA[8]（未檢測(cè)出）和SISCAN[9]（未檢測(cè)出）。因此，可以認(rèn)定PVYN-LN基因組序列無(wú)重組。

圖5 PVY-LN與世界不同的25個(gè)分離物系統(tǒng)進(jìn)化分析（登錄號(hào)|病毒名稱|株系|國(guó)家）

3 結(jié)果與討論

目前，馬鈴薯Y病毒（PVY）已成為我國(guó)侵染煙草的主要病毒。張帥等以GenBank已報(bào)道的PVY全序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，擴(kuò)增得到了Guiding-3基因組全序列，并分析得出Guiding-3與PVYN株系有較高的親緣進(jìn)化關(guān)系[10]。王彪等利用RT-PCR和5’RACE等技術(shù)克隆并測(cè)定了AQ4和FZ10兩個(gè)PVY分離物的基因組全序列，分析得出AQ4和FZ10均為N和O株系分離物的重組體[11]。陳士華等分別克隆了黑龍江、山西、貴州等3省的3個(gè)PVY的p1基因和CP基因，通過(guò)系統(tǒng)的序列分析對(duì)各分離物的株系種類進(jìn)行了鑒定。認(rèn)為各產(chǎn)區(qū)株系分化現(xiàn)象明顯，其中黑龍江分離物為PVYNTN株系，貴州分離物和山西分離物為PVYN:O株系[12]。

本研究對(duì)PVYN-LN遼寧分離物進(jìn)行了全基因組測(cè)序，通過(guò)基因組序列分析發(fā)現(xiàn)該病毒與DQ157180同源性最高，二者氨基酸序列一致率為 99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該病毒屬于已報(bào)道的PVYN株系。利用RDP4序列重組分析軟件包對(duì)PVYN-LN分析，認(rèn)為PVYN-LN未重組?；蚪M全序列的獲得為進(jìn)一步研究病毒的致病性奠定了基礎(chǔ)。

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