劉永杰，張克山，孔漢金，尚佑軍，逯忠新，劉湘濤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046）

羊傳染性膿皰 （Contagious ecthyma）（也稱羊口瘡）是由痘病毒科、副痘病毒屬羊傳染性膿皰病毒（Contagious pustular dermatitis virus，CPDV）或稱羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的綿羊、山羊和人的一種急性、接觸性、嗜上皮性傳染病，以在綿羊、山羊等動(dòng)物的唇部、鼻孔周圍、口腔黏膜和乳房等部位皮膚形成丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征，主要引起皮膚和黏膜的增生性病變［1－3］。早在1787年就有了對(duì)該病的描述，澳大利亞、新西蘭、南非、希臘、印度、美國(guó)、意大利等多個(gè) 養(yǎng)羊國(guó)家均有該病發(fā)生和流行的報(bào)道。我國(guó)有關(guān)該病的文獻(xiàn)記載最早始于1955年，目前該病廣泛分布于世界各養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)并呈不斷上升趨勢(shì)［4］。該病主要危害羔羊和部分成年羊，羔羊發(fā)病率高達(dá)100%，若繼發(fā)或混合感染其他病原微生物，則病死率較高。該病可以通過傷口感染飼養(yǎng)人員表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。因此，羊傳染性膿皰的暴發(fā)和流行不但嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展而且威脅人們的身體健康，是一種危害較為嚴(yán)重的人畜共患傳染病。

目前對(duì)于口瘡的診斷主要依靠臨床癥狀，但是往往從癥狀上易和反芻動(dòng)物的其他水泡性疾病以及羊的潰瘍性皮炎相相混淆，據(jù)報(bào)道2001年英國(guó)口蹄疫中有23%為誤診，其中有一部分就是和羊痘和羊口瘡病相混淆［5］。本文就近年來國(guó)內(nèi)外羊口瘡病臨床診斷、組織病理學(xué)診斷、病原學(xué)和血清學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行概述，以期對(duì)該病的診斷和防控提供參考。

1 羊口瘡與其他羊病的鑒別診斷

根據(jù)ORFV嗜好組織的損傷特征能夠診斷羊口瘡，但在具體的臨床診斷中，應(yīng)該與羊痘、口蹄疫、葡萄球菌引起的皮炎、嗜皮性細(xì)菌病以及潰瘍性皮膚病加以鑒別［6］。在臨床上區(qū)分羊ORFV感染和口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）主要依據(jù)是ORFV能夠引起增生性損傷而FMDV不會(huì)引起此種性質(zhì)的病變。潰瘍性皮膚病主要以皮膚、面部、足部及生殖器外部形成潰瘍和結(jié)硬皮痂為特征，這種損傷也不會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)散。與羊口瘡相比，嗜皮性細(xì)菌病的典型特征是在表皮形成連接成簇的極小的膿皰，除非羊過度疲勞，否則此病也很少引起顯著的皮膚損傷。葡萄球菌引起的皮炎以脫發(fā)為主要特征。另外，羊痘和羊口瘡病毒感染的鑒別主要通過電子顯微鏡觀察、組織病理學(xué)檢查、免疫組化、血清學(xué)試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等加以診斷和鑒別［7－9］。

2 組織病理學(xué)診斷

病羊采食、咀嚼、吞咽困難，流涎、消瘦、衰弱、精神沉郁，食欲減退或廢絕、反芻減少，嘴角、上下唇、鼻鏡和鼻孔邊緣有水皰或膿皰，破潰形成黃色或黑褐色痂塊，口腔黏膜潮紅，齒齦、頰部及軟腭上有水皰或膿瘡，多數(shù)可見鮮紅潰瘍面，口腔內(nèi)膿皰破潰后經(jīng)久不愈，表面有膜狀淡黃色沉積物。病羊經(jīng)剖檢可見面部皮下組織呈膠樣浸潤(rùn)，有化膿性壞死，氣管充血，出血，下頜淋巴結(jié)腫大。若有葡萄球菌、壞死桿菌等感染，會(huì)造成病情惡化，導(dǎo)致羔羊死亡。有繼發(fā)感染的情況下可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，真皮層可見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但該診斷方法只能做輔助性診斷，沒有針對(duì)性［10－11］。

3 流行病學(xué)診斷

本病自然感染主要由購(gòu)入病羊或帶毒羊而轉(zhuǎn)入健康羊群，引起群發(fā)，或是利用受污染的畜舍或草地而感染，潛伏期一般為4d～8d，易在羊引進(jìn)7d～21d發(fā)病，常在15d左右暴發(fā)。綿羊、山羊以3月齡～6月齡羔羊發(fā)病最多，常呈群發(fā)性流行，羔羊發(fā)病率高達(dá)100%，成年羊同樣易感，但發(fā)病較少，多為散發(fā)。本病無明顯季節(jié)性，但以春夏季發(fā)病較多。病羊和帶毒羊是主要傳染源，特別是病羊的痂皮帶毒時(shí)間較長(zhǎng)。病毒主要通過接觸感染，健康羊常因皮膚，黏膜擦傷處接觸到病源而感染發(fā)病。

4 病原學(xué)診斷

4.1 電子顯微鏡法

電子顯微鏡下觀察病毒形態(tài)是一種經(jīng)典和快速的羊口瘡診斷方法，在電鏡下可見病毒顆粒長(zhǎng)約220nm～250nm，寬約125nm～200nm，表面結(jié)構(gòu)為管狀條索斜形交叉呈“8”字型纏繞線團(tuán)狀。但是羊口瘡病毒和其他痘病毒大小相近無法通過電子顯微鏡鑒別［12］，給確診造成一定困難。

4.2 免疫電鏡法

免疫電鏡法是應(yīng)用病毒特異性抗體吸附口瘡病毒，再在電子顯微鏡下觀察副痘病毒形態(tài)，這種免疫法和電鏡法相結(jié)合增加了該診斷方法的特異性，目前使用病毒單克隆抗體特異性吸附口瘡病毒進(jìn)行免疫電鏡觀察。

4.3 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是羊口瘡診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞都可用于羊口瘡病毒的分離。在原代細(xì)胞中羔羊睪丸細(xì)胞和腎細(xì)胞是最常用的病毒分離細(xì)胞，除此之外胎牛肌細(xì)胞、胎羊真皮細(xì)胞、牛睪丸細(xì)胞、胎牛肺細(xì)胞［13］、胎羊腎細(xì)胞［14］、胎羊肌細(xì)胞也可用于病毒分離。病毒在細(xì)胞中盲傳1代～2代即可產(chǎn)生細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、退化和脫落，染色后病毒感染的細(xì)胞內(nèi)可見嗜酸性小體。

4.4 聚合酶鏈反應(yīng)

不同的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體系都可用于口瘡感染的快速檢測(cè)。一種基于B2L基因的半套式PCR方法能夠檢測(cè)臨床樣本中低拷貝數(shù)量的病毒粒子，基于B2L或VIR基因的PCR診斷方法已經(jīng)廣泛用于診斷副痘病毒屬的感染［15－17］。PPP4 和PPP1的引物組合能擴(kuò)展所有的副痘病毒，而PPP3和PPP4的引物組合則可以擴(kuò)增口瘡病毒特有的基因片段，病毒的細(xì)胞分離和和中和試驗(yàn)與PCR方法的復(fù)合率為85.7%，這說明PCR方法的敏感性高于病毒分離鑒定［18］。另外，利用 A29基因（413bp）和H3L基因（708bp）的雙重PCR方法被認(rèn)為在鑒別CPV和PRFV方面有相當(dāng)?shù)臐摿?。向智龍等以山羊痘病毒ITR基因和羊口瘡病毒H2L基因?yàn)榛A(chǔ)，建立了特異性和敏感新高的雙重PCR診斷方法［19］。

4.5 Real－time PCR診斷方法

基于B2L基因擴(kuò)增的real－time PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛用于臨床樣本中病毒檢測(cè)和定量［20－21］。

4.6 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

基于羊口瘡病毒基因組的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析是研究副痘病毒分子特征較好的工具，可以從副痘病毒成員中區(qū)分出口瘡病毒，EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ是3種常用的限制性內(nèi)切酶 ，有報(bào)道使用DraⅠ限制性內(nèi)切酶酶更利于口瘡病毒的基因分型。使用酚／氯仿抽提法可以從超速離心純化的病毒和病變結(jié)痂中獲得病毒DNA，研究證明系統(tǒng)進(jìn)化分析可用于副痘病毒的鑒定和不同毒株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析［22－23］。

4.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

向智龍等以羊口瘡病毒B2L基因保守區(qū)為模板設(shè)計(jì)了4條引物，經(jīng)過條件摸索，建立了特異性和敏感性較高的羊口瘡環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)［24］。用建立的LAMP方法對(duì)ORFV陽性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳呈特征性梯狀條帶，而綿羊痘病毒、藍(lán)舌病病毒、口蹄疫病毒、絲狀支原體山羊亞種、山羊痘病毒及健康山羊皮膚的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均無擴(kuò)增條帶。對(duì)ORFV的最低檢出量為5.3fg，比常規(guī)PCR方法靈敏度高1 000倍。

5 血清學(xué)診斷

5.1 病毒中和試驗(yàn)

血清中和試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是常用的抗體診斷試驗(yàn)，檢測(cè)疑似血清當(dāng)血清中和滴度大于8或者補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)大于20，時(shí)可認(rèn)為口瘡感染陽性。

5.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

使用純化的口瘡病毒作為抗原的間接ELISA方法，再配合使用不同動(dòng)物的免疫球蛋白可以用于檢測(cè)不同種屬動(dòng)物的口瘡病毒抗體，這種方法也被成功地應(yīng)用于駱駝、羊和人的口瘡感染檢測(cè) 。

5.3 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

在Western blot試驗(yàn)中，感染動(dòng)物的血清可以和羊口瘡病毒約40ku的免疫原性蛋白反應(yīng)，病毒的其他蛋白如20ku和22ku也可以與感染血清發(fā)生反應(yīng)。使用兔抗羊口瘡病毒多克隆抗體和純化的羊口瘡病毒進(jìn)行 Western blot可見有66、39、22、56、24、25ku的反應(yīng)條帶［25］，39ku和22ku抗原性強(qiáng)的膜蛋白可被免疫系統(tǒng)識(shí)別。

6 展望

綜上所述，世界范圍內(nèi)羊口瘡診斷技術(shù)研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，不僅原有的診斷方法得到了改進(jìn)和提高，許多新的診斷技術(shù)不斷被應(yīng)用，但無論哪種檢測(cè)方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。截至目前，還沒有一套成熟的血清學(xué)診斷方法用于ORFV的診斷。因此，敏感、快速、特異性的病原和血清學(xué)診斷是發(fā)展方向，兩種或多種診斷方法相互驗(yàn)證以增加診斷結(jié)果的可靠性是其發(fā)展趨勢(shì)。

［1］王廷璞，趙菲佚，安建平，等.羊傳染性膿皰病毒42K囊膜蛋白基因克隆及表達(dá)［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（1）：29－32.

［2］Mavrogianni C V，F(xiàn)thenakis G.Clinical，bacteriological，cytological and pathological features of teat disorders in ewes［J］.J Vet Med Series A，2007，54（4）：219－223.

［3］Mavrogianni V S，Cripps P J，Papaioannou N，et al.Teat disorders predispose ewes to clinical mastitis after challenge withMannheimiahaemolytica［J］.Vet Res，2005，37（1）：89－105.

［4］Mondal B，Bera A，Hosamani M，et al.Detection of orf virus from an outbreak in goats and its genetic relation with other parapoxviruses［J］.Vet Res Commun，2006，30（5）：531－539.

［5］Knowles N，Samuel A，Davies P，et al.Outbreak of foot－andmouth disease virus serotype O in the UK caused by apandemic strain［J］.Vet Rec，2001，148（9）：258.

［6］Watson P.Differential diagnosis of oral lesions and FMD in sheep［J］.In Practice，2004，26（4）：182－191.

［7］Nandi S，De U K，Chowdhury S.Current status of contagious ecthyma or orf disease in goat and sheep—A global perspective［J］.Small Ruminant Res，2011，96（2）：73－82.

［8］Hosamani M，Scagliarini A，Bhanuprakash V，et al.Orf：an update on current research and future perspectives［J］.Expert Rev Anti－Infe Ther，2009，7（7）：879－893.

［9］Foster A P.Staphylococcal skin disease in livestock［J］.Vet Dermatol，2012，23（4）：342－e363.

［10］Vikoren C T，Lillehaug A，Akerstedt J，et al.A severe outbreak of contagious ecthyma（orf）in a free－ranging musk ox（Ovibosmoschatus）population in Norway［J］.Vet Microbiol，2008，127（1－2）：10－20.

［11］向智龍，水 超，程振濤，等.羊口瘡的PCR檢測(cè)及病理組織學(xué)觀察［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2012，36（1）：12－13.

［12］Hosamani M，McInnes C J，Singh R K，et al.Orf：an update on current research and future perspectives［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2009，7（7）：879－893.

［13］Inoshima A Y，Murakami K，Wu D，et al.Characterization of parapoxviruses circulating among wild Japanese serows（Capricorniscrispus）［J］.Microbiol Immunol，2002，46（8）：583－587.

［14］Matsuura A K，Inoshima Y，Kameyama K E，et al.Establishment of a novel ovine kidney cell line for isolation and propagation of viruses infecting domestic cloven－h(huán)oofed animal species［J］.In Vitro Cell Deve－An，2011，47（7）：459－463.

［15］Hosamani M，Scagliarini A，Bhanuprakash V，et al.Laboratory diagnosis of contagious ecthyma：Comparison of different PCR protocols with virus isolation in cell culture［J］.J Virol Meth，2006，134（1）：119－124.

［16］Inoshima Y Z，Murakami C K，Yokoyama T，et al.Genetic heterogeneity among parapoxviruses isolated from sheep，cattle and Japanese serows（Capricorniscrispus）［J］.J Gen Virol，2001，82（5）：1215－1220.

［17］Gallina L，Mc Innes C J，Cardeti G，et al.A real time PCR assay for the detection and quantification of orf virus［J］.J Virol Meth，2006，134（1－2）：140－145.

［18］Kottaridi C J，Nomikou K，Lelli R，et al.Laboratory diagnosis of contagious ecthyma：comparison of different PCR protocols with virus isolation in cell culture［J］.J Virol Meth，2006，134（1－2）：119－124.

［19］向智龍，程振濤，卓建華，等.山羊痘病毒和羊口瘡病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（1）：88－91.

［20］Gallina L，Dal Pozzo F，Mc Innes C，et al.A real time PCR assay for the detection and quantification of orf virus［J］.J Virol Meth，2006，134（1）：140－145.

［21］Bora D，Venkatesan G，Bhanuprakash V，et al.TaqMan real－time PCR assay based on DNA polymerase gene for rapid detection of Orf infection［J］.J Virol Meth，2011，178（2）：249－252.

［22］Tikkanen M K，McInnes C J，Mercer A A，et al.Recent isolates of parapoxvirus of Finnish reindeer（Rangifertarandus tarandus）are closely related to bovine pseudocowpox virus［J］.J Gen Virol，2004，85（Pt 6）：1413－1418.

［23］Inoshima Y，Murakami K，Yokoyama T，et al.Genetic heterogeneity among parapoxviruses isolated from sheep，cattle and Japanese serows（Capricorniscrispus）［J］.J Gen Virol，2001，82（Pt 5）：1215－1220.

［24］向智龍，卓建華，鮮思美，等.羊口瘡病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（6）：588－592.

［25］Czerny C P，Waldmann R，Scheubeck T，et al.Identification of three distinct antigenic sites in parapoxviruses［J］.Arch Virol，1997，142（4）：807－821.