周艷喜，于立新，張?jiān)旅罚酵A，朱富余，么宏強(qiáng)，馬學(xué)恩＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古呼和浩特010020）

ras基因最初在大鼠肉瘤組織基因組中發(fā)現(xiàn)，kras定位于第12號(hào)染色體上，含4個(gè)編碼外顯子和1個(gè)5′端非編碼外顯子，編碼由189個(gè)氨基酸組成的Ras蛋白，因其分子質(zhì)量為21ku，又稱為p21蛋白，Ras蛋白在細(xì)胞增殖分化信號(hào)從激活的跨膜受體傳遞到下游蛋白激酶過(guò)程中起重要作用。在多數(shù)人類腫瘤組織基因組DNA中均可以檢測(cè)到ras基因突變，其中在肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌組織中最常見。ras基因家族包括3個(gè)密切相關(guān)的成員，分別為kras、hras、nras基因，其中kras基因與肺癌的關(guān)系最為密切［1-2］。pik3ca基因具有調(diào)控機(jī)體細(xì)胞增殖、分化等許多重要的生理功能，在人腦、肺、胃腸等組織中均有表達(dá)。pik3ca基因突變與腫瘤的關(guān)系和致瘤機(jī)制的研究已成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)［3-5］。pik3ca的突變4／5發(fā)生在螺旋區(qū)和激酶區(qū)這兩個(gè)區(qū)域，其突變可以減少細(xì)胞的凋亡，還可以促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)、提高其下游激酶PI3Ks的活性。大多數(shù)細(xì)胞中都存在EGFR，包括所有的表皮細(xì)胞、部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。EGFR激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中包含許多調(diào)控蛋白，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成具有重要的調(diào)控作用。在一些腫瘤細(xì)胞中常過(guò)表達(dá)，EGFR的過(guò)表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、預(yù)后差有關(guān)［6］。p53基因突變與人類肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌等腫瘤有關(guān)。人類腫瘤中p53基因突變主要發(fā)生在高度保守區(qū)內(nèi)，其中175、248、249、273、282密碼子的突變率最高，不同種類腫瘤突變位點(diǎn)和突變率不同。

從分子水平對(duì)癌癥相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測(cè)，是癌癥患者靶向治療和化療藥物選擇的輔助參考依據(jù)［7］，KRAS、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）已經(jīng)成為腫瘤分子靶向治療的公認(rèn)靶點(diǎn)。單個(gè)氨基酸突變?cè)诔掷m(xù)激活突變中具有重要的生物學(xué)意義，與導(dǎo)致的多種惡性腫瘤密切相關(guān)，根據(jù)己有的研究成果和存在問(wèn)題，本研究使用PCR-SSCP法檢測(cè)綿羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosis，OPA）病羊egfr、kras、pik3ca基因突變，期望為綿羊肺腺瘤病毒（Ovine pulmonary adenomatosis virus，OPAV）致病機(jī)理的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性病料基因組DNA 病羊肺臟組織由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理生理實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確定感染了綿羊肺腺瘤病毒并保存。陰性對(duì)照組織采自呼和浩特市某羊場(chǎng)經(jīng)鑒定未感染綿羊肺腺瘤病毒。

1.1.2 試劑 LA Taq DNA聚合酶、dNTP、IPTG、X-gal、DNA Marker DL 15 000、pMD18-T等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Tissue／Blood DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 確定 nras、kras、pik3ca、egfr、p53基因中突變高的位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增nras、kras、pikca、egfr、p53基因突變頻率高的位點(diǎn)所在外顯子（表1和表2）。

表1 kras、nras、pik3ca、egfr和p53外顯子擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers of kras，nras，pik3ca，egfr and p53

表2 kras、nras、pik3ca、egfr和p53外顯子基因檢測(cè)位點(diǎn)Table 2 Mutational sites needed to detection in kras，nras，pik3ca，egfr and p53

1.2.2 綿羊基因組DNA的提取 根據(jù)天根公司Tissue／Blood DNA提取試劑盒的操作步驟提取各樣品基因組DNA，10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度純度后置-80℃冰箱保存。

1.2.3 目的基因的PCR擴(kuò)增 以提取的OPA病羊基因組 DNA 為模板，以 NRAS1F／NRAS1R、NRAS2F／NRAS2RKRAS1F／KRAS1R、KRAS2F／KRAS2R、PIK3CA9F／PIK3CA9R，EGFR17F／EGFR17R、EGFR20F／ EGFR20R、P536F／ P536R、P537F／P537R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μL：LATaqDNA聚合酶0.25μL，dNTP 4μL，LA buffer 2.5μL，滅菌水15.25μL，上、下游引物各1μL，模板基因組DNA 1μL。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃終止反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行20g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 SSCP法檢測(cè)基因突變 PCR擴(kuò)增目的片段，20g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物中是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。取3μL PCR產(chǎn)物與3μL SSCP上樣緩沖液混合，12 000r／min離心30s。將樣品于PCR儀上95℃變性10min，立即將PCR產(chǎn)物置于冰上靜置5min。300V電泳30min后恒溫110V繼續(xù)進(jìn)行SDS凝膠電泳電泳10h。取出凝膠用去離子水洗2次，浸入100mL／L乙醇、5mL／L冰醋酸混合溶液中固定6min，用去離子水洗2次，再浸入10mL／L AgNO3溶液中染色10min，用去離子水洗3次～5次，然后浸入15g／L NaOH、4mL／L甲醛混合溶液中顯色。于成像系統(tǒng)中觀察、拍照，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果分析 PCR-SSCP結(jié)果陽(yáng)性樣品送北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用生物軟件DNA Star、CLUSTAL對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 nras、kras、pik3ca、egfr和p53基因目的外顯子擴(kuò)增

以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性病料和陰性對(duì)照組綿羊基因組DNA為模板擴(kuò)增 nras（exonl，2）、kras（exonl，2）、pik3ca（exon9）、egfr（exonl7，20）、p53（exon6，7）目的片段。基因編碼序列長(zhǎng)分別為128／179、111／179、120、123／54、109／137bp（圖1）。擴(kuò)增的片段大小與理論大小一致，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增的基因片段為目的序列。擴(kuò)增的目的片段沒(méi)有雜帶，可以用作模板進(jìn)行SSCP檢測(cè)。

圖1 目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of objective genes

2.2 SSCP檢測(cè)結(jié)果

SSCP與測(cè)序分析顯示擴(kuò)增的片段nras（exonl，2）、kras（exon2）、pik3ca（exon9）、egfr（exonl7，20）、p53（exon6）未發(fā)生突變。kras（exon1）檢測(cè)檢測(cè)到突變，p53（exon7）檢測(cè)到突變。

2.2.1 kras第1外顯子檢測(cè) SSCP圖2顯示樣品2、5PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性與陰性對(duì)照不同，樣品1、3、4的單鏈構(gòu)象多態(tài)性與陰性對(duì)照相同，外顯子的測(cè)序峰圖顯示kras（exon1）雜合型突變，外顯子核苷酸突變：35G→T（第35位核苷酸由G突變?yōu)門），編碼的氨基酸位于第12密碼子：G12→V（第12位氨基酸由G即甘氨酸突變?yōu)閂即纈氨酸）。

2.2.2 p53第7外顯子檢測(cè) 引物P537F／P537R PCR擴(kuò)增基因p53（exon7），PCR產(chǎn)物電泳結(jié)顯示137bp的條帶，綿羊與人P53在氨基酸和核苷酸水平上有很高的同源性以人p53基因第7外顯子表示綿羊突變位點(diǎn)陽(yáng)性樣品p53（exon7）檢測(cè)出突變，核苷酸突變：825T→C（圖3），編碼的氨基酸未發(fā)生突變，依然是C即半胱氨酸。

圖2 kras exon1SSCP檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of kras exon1by SSCP

圖3 p53exon7SSCP檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of p53exon7by SSCP

3 討論

綿羊肺腺瘤是由綿羊肺腺瘤病毒引起的一種成年綿羊慢性、進(jìn)行性、接觸傳染性肺臟疾病，以潛伏期長(zhǎng)，咳嗽，呼吸困難，大量漿液性鼻漏，瘦弱，肺泡和支氣管上皮進(jìn)行性腫瘤性增生和死亡率高等臨床和病理變化為主要特征［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)OPAV通過(guò)RAS／RAF／MAPK和PI3K／AKT兩種不同機(jī)制惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞［10］。

篩選單堿基突變有一系列的方法包括PCR-SSCP，等位基因競(jìng)爭(zhēng)性抑制PCR，以及“TaqMan”法基因分型。每種方法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)或不足［11］。這些方法的不足之處在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制和TaqMan法只能檢測(cè)特定的突變。TaqMan需要相對(duì)昂貴的探針用于顯示結(jié)果。PCR-SSCP需要PCR處理后產(chǎn)物，是一種常用的檢測(cè)方法，即使單鏈中出現(xiàn)單個(gè)堿基的改變也能夠檢測(cè)出來(lái)。但同時(shí)也不能排除檢測(cè)方法和標(biāo)本處理過(guò)程對(duì)結(jié)果的影響。

作為原癌基因的ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因。ras基因激活的方式有3種，即基因點(diǎn)突變、基因大量表達(dá)、基因插入及轉(zhuǎn)位。其中ras基因被激活最常見的方式就是點(diǎn)突變，多發(fā)生在N端第12、13和61密碼子，其中又以第12密碼子突變最常見，而且多為GGT突變成GTT［12］。學(xué)者采用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)hras基因第12位密碼子一甘氨酸的所有置換氨基酸的可能性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，此位點(diǎn)上，除置換氨基酸為脯氨酸外，其余的置換氨基酸均具有轉(zhuǎn)化潛能，但有程度差異。本試驗(yàn)10個(gè)陽(yáng)性樣品中檢測(cè)出2個(gè)kras基因第一外顯子突變樣品，核苷酸突變?yōu)辄c(diǎn)為35G→T，編碼的氨基酸位于第12密碼子12G→V。不同突變位點(diǎn)對(duì)P21的活化機(jī)制不同，第12密碼子突變可以減弱P21內(nèi)在的GTP酶活性，并使細(xì)胞凋亡減少、細(xì)胞間接觸抑制減弱。kras基因發(fā)生突變時(shí)，導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變，鳥苷三磷酸酶（GTPase）活性降低，p21GTP牢固結(jié)合而不被GTPase水解，一直處于激活狀態(tài)，信號(hào)傳遞持續(xù)開放，刺激細(xì)胞不斷生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞的癌變。kras基因突變?cè)诨疾【d羊肺臟腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)，推測(cè)kras基因突變可能與肺腫瘤的形成過(guò)程存在一定的關(guān)系。

野生型p53基因是一種抑癌基因。引起腫瘤形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的P53蛋白是p53基因突變的產(chǎn)物，是一種腫瘤促進(jìn)因子，它可以消除正常P53的功能。在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變，說(shuō)明該基因的改變很可能是人類腫瘤產(chǎn)生的主要發(fā)病因素。一系列的方式能使P53失活，在一些腫瘤中無(wú)義突變?cè)斐蓀53翻譯中斷。最常見的是錯(cuò)義突變，野生型與突變體形成更穩(wěn)定的四聚體，使蛋白喪失正常功能，p53基因突變后由于其空間構(gòu)象發(fā)生改變，失去了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)控作用，p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?。?shí)驗(yàn)結(jié)果提示，正常綿羊基因組為野生型，一例陽(yáng)性樣品檢測(cè)出P53突變，CDS突變825T→C，氨基酸未發(fā)生突變，不改變蛋白的結(jié)構(gòu)，可能在OPA致病過(guò)程中不起作用。

近年發(fā)現(xiàn)OPAV通過(guò)RAS／RAF／MAPK和PI3K／AKT兩種不同機(jī)制惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞［3］。有研究表明 H／N-RAS-MEK-MAPK信號(hào)通路在OPAV轉(zhuǎn)化細(xì)胞過(guò)程中是非常重要的。有必要從基因突變方面對(duì)OPAV轉(zhuǎn)化細(xì)胞的過(guò)程進(jìn)行探討。

目前國(guó)外有關(guān)人類突變頻率與癌癥的關(guān)系的研究很多，學(xué)者們對(duì)人類這些基因突變，以及基因突變對(duì)編碼蛋白功能的影響已經(jīng)有了比較深入的研究。本研究借鑒人類肺癌與基因突變關(guān)系的研究，對(duì)OPA與基因突變的關(guān)系進(jìn)行了探討，本研究在OPAV感染綿羊的組織中檢測(cè)到kras基因突變，說(shuō)明kras基因突變和腫瘤的形成可能存在一定的聯(lián)系。但對(duì)致病機(jī)制的探討還需要更深入研究。本研究中kras（exon 2）、nras（exonl、2）、pik3ca（exon 9）、egfr（exonl7、20）、p53（exon6）均未檢測(cè)出突變。但也不能排除檢測(cè)樣本的儲(chǔ)存處理等結(jié)果產(chǎn)生的影響。

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