杜冬華，周 靜，王愛華，王 磊，孫繼國

（1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，河北張家口075131；2.農(nóng)標(biāo)普瑞納飼料有限公司，河北廊坊065000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000）

傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一，病原屬雙RNA病毒科成員［1-3］。從IBDV發(fā)現(xiàn)至今，新的變異株及超強(qiáng)毒株不斷出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗已無法完全阻止IBD的發(fā)生和流行［4］，迫切需要開發(fā)更加安全、有效的新型疫苗，而且基因工程疫苗是未來發(fā)展方向［5］。目前，已知該病毒基因組共編碼VP1、VP2、VP3、VP4和VP5 5種蛋白，其中VP2蛋白是宿主保護(hù)性免疫原，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，已成為近年來眾多學(xué)者研究的熱點［6-7］。本試驗利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出IBDV HB株VP2蛋白，探索其用于免疫預(yù)防的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及抗體 IBDV HB株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物衛(wèi)檢實驗室分離鑒定并保存，經(jīng)生物學(xué)測定及VP2基因序列分析為中等毒力毒株，且經(jīng)驗證將其作為活疫苗接種雛雞效果良好；鼠抗IBDV HB株陽性血清由河北北方學(xué)院動物傳染病實驗室制備；羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 重組質(zhì)粒 含有VP2完整基因序列的重組質(zhì)粒pBS-VP2由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物衛(wèi)檢實驗室構(gòu)建，目的基因全長1542bp，并分別在上、下游引物引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將含VP2基因的重組質(zhì)粒pBS-VP2用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，膠回收目的片段；原核表達(dá)載體pET-32a-c（＋）做同樣的酶切回收處理；二者連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽性重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-VP2。

1.2.2 VP2基因的表達(dá) 重組質(zhì)粒pET-VP2轉(zhuǎn)化表 達(dá) 菌 株 BL21（DE3），接 入 含 有 Amp（200μg／mL）的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600nm到0.6，加入IPTG至終濃度1mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)3h。表達(dá)蛋白參考文獻(xiàn)［8］方法，用75g／L的SDS-PAGE、Western blot檢測。

1.2.3 重組蛋白的大量表達(dá) 挑取重組菌單菌落接種于10mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，接入2 000mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基，按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)。參考文獻(xiàn)［8］，測定蛋白溶解性，純化表達(dá)蛋白。

1.2.4 表達(dá)重組蛋白的動物免疫 表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，凝膠在預(yù)冷的0.25mol／L KCl溶液浸泡2min，顯示蛋白條帶后，將目的蛋白條帶切下純化回收。將純化的VP2蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化，Balb／c小鼠背部皮下注射，每只小鼠50μg／只，共免疫6只。初次免疫后每2周加強(qiáng)免疫1次，第3次免疫接種后7d，斷尾采血，分離血清，用間接ELISA方法檢測抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP2的酶切鑒定

對重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP2用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果切出兩個條帶，分別為載體片段和目的基因約1 500bp。結(jié)果表明，目的基因已連接到pET-32a-c（＋）表達(dá)載體上（圖1）。

圖1 重組表達(dá)載體pET-VP2雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant pET-VP2 by enzyme digestion

2.2 重組蛋白的表達(dá)

重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析，出現(xiàn)一條約55ku條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，而未誘導(dǎo)的載體及空載體pET-32a未出現(xiàn)這一條帶（圖2）。

2.3 Western blot鑒定分析

將目的蛋白和空載體表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE，再轉(zhuǎn)移到NC膜上，用鼠抗IBDV HB株陽性血清作為一抗與之進(jìn)行特異性結(jié)合，再經(jīng)過HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗顯色反應(yīng)，出現(xiàn)一條特異性的抗原抗體結(jié)合帶，而空載體則沒有，證明表達(dá)的目的蛋白是VP2蛋白，且具有良好的特異性和反應(yīng)原性（圖3）。

2.4 免疫小鼠抗重組蛋白血清效價的檢測

將純化后的重組蛋白以最佳包被濃度（1∶200，15μg／mL）包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，按文獻(xiàn)［9］方法，以加強(qiáng)免疫后的血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗，間接ELISA方法測定VP2蛋白免疫小鼠后血清抗體效價，并設(shè)陰性血清對照組，結(jié)果見表1。

［10］方法判定結(jié)果（P≥N＋3SD為陽性），經(jīng)計算陰性血清的OD 490nm平均值為0.088，標(biāo)準(zhǔn)方差等于0.022，因此陰陽性的臨界值為0.154（0.088＋3×0.022），即受檢血清的抗體效價為OD 490nm值高于0.154的最高血清稀釋倍數(shù)。

由表1可看出，在免疫小鼠中，產(chǎn)生的ELISA抗體效價可高可達(dá)1∶12 800，且大多數(shù)免疫小鼠抗體效價在1∶6 400以上。由此表明，體外表達(dá)的VP2蛋白免疫原性良好。

圖2 大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)的VP2融合蛋白Fig.2 The expression of VP2fusion protein in BL21（DE3）E.coli

圖3 Western blot檢測表達(dá)的目的蛋白Fig.3 VP2fusion protein identified by Western blot

表1 重組蛋白pET-VP2免疫接種小鼠后血清ELISA抗體效價（OD 490）Table 1 The ELISA titers of antibodies against recombinant protein pET-VP2in sera of mice after immunization（OD 490）

3 討論

本研究使用pET-32a原核表達(dá)系統(tǒng)對IBDV HB株VP2蛋白進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白分子質(zhì)量約58ku。Western blot檢測目的蛋白，用鼠抗IBDV HB株株的陽性血清作為一抗與之進(jìn)行特異性結(jié)合，再經(jīng)過 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗的顯色反應(yīng)，目的蛋白處出現(xiàn)一條特異性的抗原抗體結(jié)合帶，而空載體則沒有，從而證明表達(dá)的目的蛋白是VP2蛋白，同時也表明重組蛋白具有反應(yīng)原性。

本研究旨在探索用重組VP2蛋白預(yù)防傳染性法氏囊病的可行性，純化的重組蛋白免疫試驗小鼠后，間接ELISA方法檢測血清抗體水平。結(jié)果表明，該重組蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體，充分證明重組的VP2蛋白具有很好的免疫原性，為研制新型的IBD基因工程疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)，但其生產(chǎn)成本、免疫劑量及免疫佐劑等方面的問題都有待進(jìn)一步解決。

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