向 敏，高其雙，陳志華，黃海軍，盧 順，彭 霞，陶弼菲，占才耀，夏 瑜，華 娟，童偉文，王蓮芳

（武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430208）

近年來，流行的甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感，傳播速度快，波及范圍廣，給人們的健康和養(yǎng)殖業(yè)帶來了新的威脅。直到目前，人類還沒有研制出用于治療流感的特效藥物，預(yù)防和控制流感主要依靠接種流感疫苗。在我國，流感疫苗的生產(chǎn)還主要依靠傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)技術(shù)[1]。這種技術(shù)需要耗用大量的優(yōu)質(zhì)雞胚，生產(chǎn)成本高，質(zhì)量難以控制。此外，利用雞胚生產(chǎn)流感疫苗，在處理廢棄的雞胚殘體時只能采用焚燒或其他無害化的處理方法，對環(huán)境有一定的污染。相比之下，細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒具有周期短、質(zhì)量易控制、抗原性好和環(huán)保等優(yōu)點，所以WHO建議使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒來替代雞胚制備流感疫苗[2]。國內(nèi)外的研究者也將細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒作為流感疫苗研究的方向，探索用細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的生產(chǎn)工藝。目前用于培養(yǎng)流感病毒的細(xì)胞主要有MDCK細(xì)胞和猴腎細(xì)胞（Vero），關(guān)于流感病毒疫苗的研究也主要依靠這兩種細(xì)胞[3]。因此，尋找新的適合于流感病毒增殖的細(xì)胞，能為流感病毒及其疫苗的研究工作提供更多的選擇。

本研究取胎羊腎組織制備原代細(xì)胞，研究胎羊腎細(xì)胞用于流感病毒增殖的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及毒株 MDCK細(xì)胞由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院惠贈；H1N1亞型流感病毒A／WS／33株購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心，由本研究室保存。

1.1.2 雞胚與實驗動物 SPF雞胚購自梅里亞維通公司；懷孕60d的健康麻城黑山羊。

1.1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（粉劑）、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶購自GIBCO公司；新生牛血清購自武漢雙博亞農(nóng)業(yè)生物科技有限公司；雙抗和TPCK胰酶購自Sigma公司；地高辛糖苷鍵分析試劑盒（DIG glycan differentiation kit）購自Roche公司；熒光素標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體購自Jackson公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液和消化液的配制 細(xì)胞培養(yǎng)液及消化液參考文獻(xiàn)[4]所述的方法進(jìn)行配制。細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM高糖培養(yǎng)基按說明書配制成溶液，0.22μm濾膜過濾除菌，加入150mL／L胎牛血清（或新生牛血清）和青霉素、鏈霉素各100單位／L，4℃保存?zhèn)溆?。消化液：取胰蛋白酶粉劑，?.01mol／L的無Ca、Mg的PBS配制成2.5g／L胰蛋白酶－0.2mL／L EDTA 的細(xì)胞消化液，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝10mL小瓶，置－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞分離與原代培養(yǎng) 將懷孕60d的母羊麻醉，在無菌環(huán)境中作剖腹手術(shù)取出胎兒，立即放入盛有約100mL滅菌無Ca、Mg的PBS的燒杯中，密封杯口，快速移入無菌室，在超凈工作臺內(nèi)取出胎兒腎組織。參考文獻(xiàn)[5]所述的方法，用眼科剪將腎皮質(zhì)區(qū)域剪成糜狀，吸取無Ca、Mg的PBS液反復(fù)沖洗，加入消化液于37℃消化30min，離心收集細(xì)胞制備成單個細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個／mL，分裝于100mL規(guī)格的一次性細(xì)胞瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.2.3 腎上皮細(xì)胞的初步純化和傳代 原代細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶底之后，吸棄培養(yǎng)上清，用細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。將消化好的細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸，參考文獻(xiàn)[6]對原代細(xì)胞進(jìn)行初步純化。具體方法：重懸的細(xì)胞于37℃靜置30min，稍加振蕩，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁的細(xì)胞一起吸到另一細(xì)胞瓶中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后，按此方法進(jìn)一步純化。3次純化后，細(xì)胞按1∶2的比例（1瓶內(nèi)的細(xì)胞接種到2個細(xì)胞瓶內(nèi)）進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4 流感病毒受體的檢測 取生長狀態(tài)良好的胎羊腎細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用地高辛糖苷鍵分析試劑盒中地高辛標(biāo)記的凝集素DIG－SNA和DIG－MAA作為一抗，于室溫下與待檢的細(xì)胞孵育1h。PBS洗滌3次以后，加入熒光素標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，室溫下避光孵育1h。再次用PBS洗滌3次，置熒光顯微鏡下觀察。同法檢測MDCK細(xì)胞流感病毒受體，并設(shè)置一抗空白對照。

1.2.5 流感病毒增殖試驗

1.2.5.1 流感病毒的準(zhǔn)備 H1N1亞型流感病毒經(jīng)SPF雞胚傳代擴(kuò)增后，無菌收獲尿囊液，置－80℃凍存?zhèn)溆?。接種前，用含2μg／mL TPCK胰酶的維持液（含20g／L FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基）稀釋病毒。

1.2.5.2 病毒增殖及血凝價測定 選取培養(yǎng)48h生長良好的胎羊腎細(xì)胞若干瓶，棄去培養(yǎng)液，向每個瓶中加入稀釋的病毒液1mL，搖晃使病毒液沾滿細(xì)胞培養(yǎng)面，移入37℃培養(yǎng)箱靜置1h，讓病毒充分吸附細(xì)胞。吸附后向培養(yǎng)瓶中補加維持液5mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每12h在顯微鏡下觀察細(xì)胞一次，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上細(xì)胞病變時，立即將培養(yǎng)瓶移入－20℃冰箱中凍融2次，收獲凍融物，直接血凝法測定病毒的血凝價[7]。同法用于 MDCK細(xì)胞檢測，重復(fù)試驗5次。

1.2.5.3 病毒在不同代次細(xì)胞中增殖的情況 將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連傳10代。每代細(xì)胞長滿單層后，用流感病毒進(jìn)行感染，待細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變時收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并凍融2次，直接血凝法測定每代細(xì)胞培養(yǎng)物的血凝價。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況

原代的胎羊腎細(xì)胞靜置培養(yǎng)至3d時，可看到部分細(xì)胞已貼壁生長，從形態(tài)上看主要是圓粒狀細(xì)胞，也有一些長梭形的纖維細(xì)胞。培養(yǎng)至5d時，大部分貼壁的細(xì)胞均能分裂繁殖并形成細(xì)胞克隆，圓粒狀細(xì)胞和梭形細(xì)胞克隆之間的界限較為明顯（圖1A）。經(jīng)初步純化后，大部分纖維細(xì)胞被去除，剩下的細(xì)胞經(jīng)3次傳代培養(yǎng)后，具有典型的上皮細(xì)胞特征。細(xì)胞的形態(tài)呈多角形，形態(tài)均一，折光性好，細(xì)胞之間排列緊密，形成鵝卵石樣的單層聚集（圖1B）。經(jīng)數(shù)代體外培養(yǎng)，細(xì)胞的生長速度加快，由最初的5d傳代一次變?yōu)?d傳代一次。

圖1 原代的胎羊腎細(xì)胞和傳代的胎羊腎細(xì)胞（10×10）Fig.1 Primary goat embryonic kidney cells and subculture goat embryonic kidney cells（10×10）

2.2 細(xì)胞表面受體的檢測

間接免疫熒光試驗結(jié)果顯示，胎羊腎細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，表明細(xì)胞表面有較為豐富的α2，6－Gal和α2，3－Gal受體（圖2）。其中α2，6－Gal受體的熒光信號較MDCK細(xì)胞組更強烈，提示胎羊腎細(xì)胞的α2，6－Gal受體的含量比MDCK細(xì)胞更為豐富。未加一抗的細(xì)胞對照均無明顯的熒光信號。

2.3 病毒增殖情況

胎羊腎細(xì)胞在感染流感病毒24h后，開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞逐漸變圓，脫落。同樣處理的MDCK細(xì)胞在接毒后40h才出現(xiàn)病變。通過比較5次血凝試驗所測得的血凝價發(fā)現(xiàn)，胎羊腎細(xì)胞培養(yǎng)物的血凝價比MDCK細(xì)胞對照的血凝價稍高，具體見表1。

圖2 胎羊腎細(xì)胞表面流感病毒受體的檢測（40×10）Fig.2 Detection of influenza virus receptors on the surface of goat embryonic kidney cells（40×10）

表1 流感病毒血凝價的測定Table1 Determination of hemagglutination titers of influenza virus

通過測定不同代次胎羊腎細(xì)胞病毒培養(yǎng)物的血凝價發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞傳代沒有對病毒的增殖造成明顯的影響，10代細(xì)胞培養(yǎng)物的血凝價穩(wěn)定在29以上（圖3）。

圖3 流感病毒在不同代次胎羊腎細(xì)胞培養(yǎng)物中的血凝價Fig.3 Hemagglutination titers influenza virus in different generations of goat embryonic kidney cell culture

3 討論

根據(jù)細(xì)胞對不同病毒易感性的差異，人們可選擇合適的細(xì)胞用于不同病毒的培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)。在體外培養(yǎng)中，較容易獲得成功的是幼年動物的腎組織上皮細(xì)胞。比如豬腎細(xì)胞 （PK－15）、乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK－21）、MDCK細(xì)胞和 Vero細(xì)胞等，均源于動物的腎臟組織。本研究選取胎羊的腎上皮細(xì)胞作為研究對象，研究其用于流感病毒增殖的可能性。初步的研究結(jié)果表明，該細(xì)胞可進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，且能用于流感病毒的增殖，具有很好的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果表明，貼壁培養(yǎng)的胎羊腎細(xì)胞含有上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。利用成纖維細(xì)胞貼壁較快的特點，對原代細(xì)胞進(jìn)行了初步的分離純化，最終得到了較典型的上皮樣細(xì)胞。原代的腎上皮細(xì)胞近似圓粒狀，貼壁較淺。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，逐漸變?yōu)槎嘟切危L速度有所加快。這說明胎羊腎細(xì)胞能適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境，且具有穩(wěn)定增殖的能力。

一種細(xì)胞是否對某種病毒易感，與該細(xì)胞表面的受體差異有很大的關(guān)系[8]。研究胎羊腎細(xì)胞表面的流感病毒受體，可直接證明該細(xì)胞用于增殖流感病毒的潛能。流感病毒的受體主要有α2，3－Gal和α2，6－Gal兩種[9]，受體表達(dá)的豐度將直接影響到病毒的復(fù)制效率。間接免疫熒光結(jié)果顯示，胎羊腎細(xì)胞表面的流感病毒受體，特別是α2，6－Gal受體，含量明顯高于流感病毒研究中最常用的MDCK細(xì)胞，這可能是用本細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒血凝價高于MDCK細(xì)胞的原因之一。病毒增殖試驗進(jìn)一步證實該細(xì)胞能用于培養(yǎng)流感病毒，且細(xì)胞的傳代培養(yǎng)對病毒的增殖沒有造成明顯的影響。當(dāng)然，本研究僅用了H1N1亞型流感病毒，是否所有A型流感病毒都能在該細(xì)胞內(nèi)大量增殖還有待研究。

目前用于增殖流感病毒的細(xì)胞主要是MDCK細(xì)胞和Vero細(xì)胞，但這兩種細(xì)胞表面的病毒受體表達(dá)豐度并不高[10]，導(dǎo)致細(xì)胞對病毒的敏感性偏低。本研究所獲得的胎羊腎細(xì)胞兼具敏感性高和產(chǎn)毒量大的特點，如果能將該細(xì)胞馴化成傳代細(xì)胞，則有望開發(fā)成一種新的流感疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞系。此外，該細(xì)胞感染流感病毒后，病變較快，可及時得知接毒是否成功，這對病毒分離和培養(yǎng)非常有利。

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