張彥文，姚權(quán)，許商成，余爭平，張廣斌

隨著電子技術(shù)的不斷進(jìn)步，毫米波技術(shù)迅猛發(fā)展，且廣泛應(yīng)用于通訊、遙感、地下探測、導(dǎo)航、醫(yī)療等方面。毫米波在醫(yī)療方面的應(yīng)用與其熱效應(yīng)有關(guān)。較低劑量毫米波輻照下，皮膚溫度上升緩慢，且上升幅度有限，可保持一定的熱效應(yīng)從而達(dá)到治療的目的。但較高劑量的毫米波輻照可使皮膚溫度快速上升，較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到痛覺閾值，產(chǎn)生劇烈疼痛，如持續(xù)輻照則可產(chǎn)生皮膚損傷甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量毫米波(35GHz)急性輻照30s，SD大鼠皮膚溫度即可達(dá)48℃以上，產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，造成皮膚損傷，且大鼠局部皮膚中P物質(zhì)(substance P，SP)含量明顯升高[3]。脊髓是疼痛沖動向高級中樞傳遞的中轉(zhuǎn)站，是疼痛傳入系統(tǒng)的重要組成部分，對疼痛的傳入起調(diào)制作用。本研究通過檢測脊髓SP和c-fos的表達(dá)變化，進(jìn)一步探索毫米波痛覺效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RT-PCR試劑盒、SYBER Green I熒光染料購自Toyoba公司，小鼠抗c-fos單克隆抗體(2G9C3)購自美國Abcam公司，小鼠抗GAPDH單克隆抗體(KC-5G4)購自上?？党晒?。

1.2 主要儀器 Bio-Rad普通PCR儀和定量PCR儀，Du-640紫外分光光度計(jì)，水平電泳儀，垂直電泳儀，凝膠圖像成像系統(tǒng)，Bio-Rad蛋白電泳系統(tǒng)，Odyssey熒光掃描儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康成年SD大鼠96只，雌雄各半，體重250±20g，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，自由進(jìn)水、飲食。隨機(jī)分為對照組、輻照30s組、輻照1min組、輻照3min組，每個(gè)輻照組在輻照后又分為0min、5min、10min、1h、3h五個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只實(shí)驗(yàn)動物。

1.4 輻照模型 將大鼠置于毫米波反射系數(shù)為零的毫米波暗室內(nèi)進(jìn)行輻照，室內(nèi)溫度控制在20℃，相對濕度80%。輻照前大鼠背部局部脫毛，輻照時(shí)將大鼠放置于自制容器中固定，局部脫毛皮膚暴露于毫米波焦斑處，用毫米波(35GHz，40W/cm2)分別輻照30s、1min、3min。毫米波輻照后，以20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，剪開背部皮膚及肌肉組織，取出輻照皮膚對應(yīng)節(jié)段的脊髓組織，用生理鹽水洗去血跡，備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Real-time RT-PCR檢測大鼠脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá) 取脊髓組織標(biāo)本(每只大鼠50mg左右)，采用Trizol試劑盒提取總RNA，具體操作按說明書進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)電泳鑒定，并行紫外分光光度計(jì)檢測含量及純度后備用。取總RNA 1.0μg，65℃變性5min后冷卻，加入M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶，在總體積20μl的反應(yīng)體系中42℃反應(yīng)60min，85℃、5min滅活M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶，冷卻至4℃用于Realtime PCR。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃15s，58℃ 20s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 90s。采用2－ΔΔCt法計(jì)算產(chǎn)物相對含量。引物序列如下：GAPDH上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'，擴(kuò)增片段長度138bp；SP上游5'-ACTGGTCCGACAGTGACCAAATC-3'，下游5'-CCCGTTTGCCCATTAATCCA-3'，擴(kuò)增片段長度117bp；c-fos上游5'-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3'，下游5'-AAAGTTGGCACTAGAGACGGACAGA-3'，擴(kuò)增片段長度170bp。

1.6 Western blotting檢測大鼠脊髓c-fos蛋白表達(dá)取脊髓組織標(biāo)本(每只大鼠50mg左右)，加入1ml組織蛋白裂解液，勻漿，冰上冷浴30min，4℃條件下20 000×g離心30min，取上清，Lowry法測定蛋白含量，分裝，－80℃保存。制備15%分離膠和5%濃縮膠，取100μg總蛋白上樣后電泳。先用80V電壓將樣品電泳至分離膠面，然后調(diào)整電壓至100V，電泳100min，轉(zhuǎn)印至NC膜上(150mA，40min)，于PBS配制的5%脫脂奶粉中封閉3h，1∶10 000小鼠抗GAPDH室溫孵育90min。取出孵育完畢的NC膜，用0.1% TBST在搖床上中度洗膜10min×3次，置于小鼠c-fos單克隆抗體(1∶1000)中室溫?fù)u床孵育3h，以TBST洗滌10min×3次，置于山羊抗小鼠紅色熒光二抗(1∶5000)中，室溫于搖床上輕度晃動，避光孵育1h，TBST避光洗滌10min×3次，PBS洗膜5min×2次，蒸餾水漂洗，除去殘留的TBST；采用Odyssey熒光掃描分析測定吸光度(A)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SP、c-fos、GAPDH PCR產(chǎn)物的電泳鑒定Real-time RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，SP、c-fos和GAPDH擴(kuò)增片段長度與實(shí)際相符，無非特異性擴(kuò)增，無DNA污染(圖1)。

2.2 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚30s后對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)的變化 經(jīng)毫米波急性輻照大鼠局部皮膚30s，輻照后各時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA相對表達(dá)水平與對照組相比均無顯著差異(P＞0.05，圖2)。

圖1 大鼠脊髓SP、c-fos、GAPDH PCR產(chǎn)物的電泳鑒定Fig. 1 Identification of SP, c-fos and GAPDH PCR production in rat spinal cord1. DNA marker; 2. GAPDH; 3. c-fos; 4. SP; 5. Negative control

2.3 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚1min后對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)的變化 經(jīng)毫米波急性輻照大鼠局部皮膚1min，在輻照后10min對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA相對表達(dá)水平與對照組相比顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，而其他時(shí)間點(diǎn)與對照組比較均無明顯差異(P＞0.05，圖3)。

圖2 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚30s后對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)變化(n=6)Fig. 2 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to millimeter wave (MMW) for 30s in rats (n=6)

圖3 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚1min后對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)變化(n=6)Fig. 3 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to MMW for 1min in rats (n=6)(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control

2.4 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚3min后對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)的變化 經(jīng)毫米波輻照大鼠局部皮膚3min，在輻照后5min和10min對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA相對表達(dá)水平與對照組相比明顯升高(P＜0.01)，輻照后1h仍顯著高于對照組(P＜0.05)，而輻照后即刻和3h與對照組相比無顯著差異(P＞0.05，圖4)。

2.5 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚對對應(yīng)節(jié)段脊髓c-fos蛋白表達(dá)的影響 毫米波急性輻照SD大鼠局部皮膚30s和1min后，對應(yīng)節(jié)段脊髓c-fos蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比均無顯著差異(P＞0.05)；而經(jīng)毫米波輻照大鼠局部皮膚3min，在輻照后5min及10min對應(yīng)節(jié)段脊髓c-fos蛋白表達(dá)與對照組相比顯著升高(P＜0.01)，其他時(shí)間點(diǎn)c-fos蛋白表達(dá)水平與對照組相比無明顯差異(P＞0.05，圖5)。

圖4 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚3min后對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)變化(n=6)Fig. 4 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to MMW for 3min in rats (n=6)(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control

3 討 論

脊髓背角是疼痛沖動向高級中樞傳遞的中轉(zhuǎn)站，是疼痛傳入系統(tǒng)的重要組成部分，也是腦干下行抑制的作用部位，對疼痛的傳入起調(diào)制作用。解剖學(xué)、免疫組織化學(xué)研究揭示，感覺神經(jīng)元及其周圍和中樞的投射區(qū)內(nèi)存在一些肽類，其中包括SP[4]。SP由速激肽家族的前速激肽A基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工后產(chǎn)生，在傷害性刺激、炎性反應(yīng)、腺體分泌、變態(tài)反應(yīng)中均具有不同作用。SP通過受體參與脊髓傷害性信息的傳遞，在痛覺調(diào)制中發(fā)揮重要作用[5-6]。

研究表明，SP可加強(qiáng)C纖維誘發(fā)的脊髓背角傷害性神經(jīng)元放電，在貓脊髓背角微電泳導(dǎo)入SP可引起傷害性感受神經(jīng)元的去極化，其時(shí)程與誘發(fā)放電的興奮效應(yīng)相平行，表明傷害性初級傳入釋放的SP能作用于突觸后神經(jīng)元，使突觸后膜發(fā)生離子通透性變化及電位變化，從而改變突觸后神經(jīng)元的功能狀態(tài)，激活傷害感受神經(jīng)元，完成信息傳遞的功能[7]。由此可見SP是傷害性傳入末梢釋放的一種興奮性遞質(zhì)，在脊髓水平參與傷害性信息傳遞，產(chǎn)生致痛作用。傷害性刺激可引起脊髓背角傷害性敏感神經(jīng)元興奮，背根神經(jīng)節(jié)小型神經(jīng)元胞體內(nèi)合成的SP經(jīng)快速軸漿運(yùn)輸至初級傳入神經(jīng)元的外周端神經(jīng)末梢，使局部皮膚SP含量升高。前期研究發(fā)現(xiàn)，毫米波急性輻照后局部皮膚SP含量升高(輻照后第5min和10min顯著升高)[3]，這可能是由于對應(yīng)節(jié)段脊髓SP mRNA表達(dá)水平升高導(dǎo)致合成的SP蛋白增加，然后經(jīng)快速軸漿運(yùn)輸至皮膚游離神經(jīng)末梢所致。

即刻早期基因是指在受到外界刺激時(shí)機(jī)體在短期(數(shù)分鐘)內(nèi)即刻表達(dá)的基因，甚至不被蛋白合成抑制劑所阻斷，其轉(zhuǎn)錄是快速、一過性的，在體內(nèi)發(fā)揮第三信使的作用。c-fos原癌基因是即刻早期基因中的一種，參與細(xì)胞的正常生長、分化過程，c-Fos蛋白可耦聯(lián)細(xì)胞外信息與細(xì)胞內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，是激活神經(jīng)元的第二信使與目的基因表達(dá)之間的信息傳遞中介，起到核內(nèi)第三信使的重要作用，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)與痛覺調(diào)控密切相關(guān)[8]。在正常生理狀態(tài)下，c-fos基因在多種細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)，但缺氧、光線刺激、機(jī)械刺激、疼痛刺激等可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos基因的表達(dá)，是刺激作用下最早的反應(yīng)基因[9]，且其表達(dá)可作為接受一定刺激后神經(jīng)元激活的標(biāo)志[10]。但不同的刺激是否通過共同的機(jī)制誘導(dǎo)c-fos表達(dá)，或者不同的刺激有不同的誘導(dǎo)機(jī)制目前尚不清楚。

圖5 毫米波急性輻照對脊髓c-fos蛋白表達(dá)的影響(n=6)Fig. 5 Effects of acute MMW irradiation on c-fos protein expression in rat spinal cord (n=6)(1)P＜0.01 compared with control

各種傷害性刺激均可誘導(dǎo)c-fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多級神經(jīng)元中的表達(dá)。在脊髓水平，急性疼痛刺激后2h，c-fos的表達(dá)即可作為神經(jīng)元活化的標(biāo)志物[11]。脊髓存在不同的傷害性傳入通路，盡管表達(dá)部位、時(shí)程、數(shù)量有一定差異，但其表達(dá)多出現(xiàn)在疼痛相關(guān)區(qū)域[12]。作為快速反應(yīng)基因家族的一員，c-fos基因的表達(dá)具有快速、短暫的時(shí)間依賴性特征。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激作用時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-fos基因在數(shù)分鐘內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá)，解除相應(yīng)刺激后，其表達(dá)也很快消失，不能持續(xù)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，外周傷害性刺激后脊髓內(nèi)初級傳入神經(jīng)末梢釋放SP、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)，可影響突觸后神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+濃度，提高cAMP水平，導(dǎo)致c-fos基因的表達(dá)[13]。同時(shí)，SP與其相應(yīng)的受體結(jié)合也可促進(jìn)c-fos的表達(dá)[14]。外周傷害性熱刺激也可引起大鼠脊髓c-fos的表達(dá)增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，毫米波急性輻照大鼠局部皮膚后，對應(yīng)節(jié)段脊髓c-fosmRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，且與脊髓SP mRNA表達(dá)和皮膚SP含量變化在時(shí)相上存在一定相關(guān)性[3]，提示毫米波輻照后皮膚SP含量增加可能與輻照導(dǎo)致的熱疼痛刺激誘導(dǎo)對應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos的表達(dá)增加有關(guān)，但其具體作用途徑尚有待進(jìn)一步研究。

[1] Xu ZW, Wu YH, Yuan GJ, et al. Preliminary studies on the effects of high-power millimeter wave on the behavioral changes and lethality in mice[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(11)∶ 1298-1301.[徐志偉, 吳永紅, 袁廣江, 等. 高功率毫米波持續(xù)急性照射對小鼠行為變化和致死效應(yīng)影響的初步研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(11)∶ 1298-1301.]

[2] Gao Y, Yuan GJ, Li ZH, et al. Damage to mice skin produced by acute and continuous high power millimeter wave irradiation[J].Med J Chin PLA, 2010, 35(11)∶ 1306-1310.[高艷, 袁廣江, 李志慧, 等. 高功率毫米波急性持續(xù)輻照對小鼠皮膚損傷的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(11)∶ 1306-1310.]

[3] Zhang YW, Yao Q, Yu ZP, et al. Effects of millimeter wave radiation on substance P and histomorphology in rat skin[J]. J Third Mil Med Univ, 2012, 34(21)∶ 2163-2166.[張彥文, 姚權(quán),余爭平, 等. 毫米波輻照對大鼠局部皮膚P物質(zhì)和組織形態(tài)學(xué)的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(21)∶ 2163-2166.]

[4] Burke J, Watson R, Mecromack D, et al. Intervertebral discs which cause low back pain secrete high levels of proinflammatory mediators[J]. J Bone Joint Surg Br, 2002, 84(2)∶ 196-201.

[5] Todd AJ, Puskar Z, Spike RC, et al. Projection neurons in lamina I of rat spinal cord with the neurokinin 1 receptor are selectively innervated by substance P-containing afferents and respond to noxious stimulation[J]. J Neurosci, 2002, 22(10)∶ 4103-4113.

[6] Zhu ZY, Yang XQ. Changes of calcitonin gene-related peptide and substance P in the blood of rats with chronic constriction injury of trigeminal nerve[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(4)∶376-378.[朱遵燕, 楊曉秋. 三叉神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)大鼠血降鈣素基因相關(guān)肽及P物質(zhì)變化[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011,36(4)∶ 376-378.]

[7] Sorkin LS, Wallace MS. Acute pain mechanisms[J]. Surg Clin North Am, 1999, 79(2)∶ 213-229.

[8] Pinto M, Lima D, Tavares I. Neuronal activation at the spinal cord and medullary pain control centers after joint stimulation∶A c-fos study in acute and chronic articular inflammation[J].Neuroscience, 2007, 147(4)∶ 1076-1089.

[9] Mikula M, Gotzmann J, Fischer AN, et al. The proto-oncoprotein c-fos negatively regulates hepatocellular tumorigenesis[J].Oncogene, 2003, 22(43)∶ 6725-6738.

[10] Mouritsen H, Janssen BU, Liedvogel M, et al. Cryptochromes and neuronal-activity markers colocalize in the retina of migratory birds during magnetic orientation[J]. PNAS, 2004,101(39)∶ 14294-14299.

[11] Coggeshall RE. Fos, nociception and the dorsal horn[J]. Prog Neurobiol, 2005, 77(5)∶ 299-352.

[12] Li X, Lighthall G, Liang DY, et al. Alterations in spinal cord gene expression after hindpaw formain injection[J]. J Neurosci Res,2004, 78(4)∶ 533-541.

[13] Caudle RM, Mannes AJ, Keller J, et al. Sensitization of spinal cord nociceptive neurons with a conjugate of substance P and cholera toxin[J]. BMC Neurosci, 2007, 8(30)∶ 1186-1195.[14] Zafer S. Multiple neurotransmitter receptors contribute to the spinal Fos expression[J]. Brain Res, 2005, 1033(2)∶ 202-209.[15] Zeng X, Huang H, Hong Y. Effects of intrathecal BAM22 on noxious stimulus-evoked c-fos expression in the rat spinal dorsal horn[J]. Brain Res, 2004, 1028(2)∶ 170-179.