李樹武，王邦茂(1.天津港口醫(yī)院，天津 300456;.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

Wnt信號系統(tǒng)是近年來在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤研究中的一大熱點(diǎn)［1－4］。β－catenin是Wnt信號傳導(dǎo)通路中的重要成員，β－catenin介導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)通路異常激活與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，同時(shí)β－catenin在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。法尼酯X受體(farnesoid x receptor，F(xiàn)XR)在腸肝循環(huán)中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)膽汁酸和脂類代謝，同時(shí)在腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。FXR基因的缺失可以激活Wnt通路而促進(jìn)腫瘤形成。本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測β－catenin、FXR蛋白在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌中的表達(dá)及其關(guān)系，現(xiàn)將具體情況報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集我院普外科2008年6月～2011年9月行手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本60例，男32例，女28例，平均年齡53.3歲;其中結(jié)腸癌34例，直腸癌26例，大腸腺瘤30例，其中男18例，女12例，平均年齡55.5歲;正常大腸黏膜20例，其中男12例，女8例，平均年齡51.6歲。以上標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。

1.2 主要試劑:兔抗人β－catenin多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，工作濃度1∶300，兔抗人FXR多克隆抗體購自SANTA CRUZ(美國)，工作濃度1∶100。

1.3 免疫組織化學(xué)方法:采用二步法染色:所有標(biāo)本均做4μm連續(xù)切片，作HE和免疫組織化學(xué)染色。兩種抗體孵育前，切片均經(jīng)微波抗原修復(fù)，具體方法參照說明書。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知大腸癌陽性組織作為陽性對照。1.4 結(jié)果判斷:陽性標(biāo)志以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為具體標(biāo)準(zhǔn)，按照Maruyama等方法進(jìn)行β－catenin染色判斷［5］:從細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核三個(gè)方面判斷β－catenin的表達(dá)特征，每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野，正常β－catenin表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜:當(dāng)＞70%細(xì)胞膜陽性表達(dá)者為正常表達(dá)，反之為細(xì)胞膜表達(dá)缺失;當(dāng)＞10%細(xì)胞漿或細(xì)胞核陽性表達(dá)者為異位表達(dá)。FXR定位于細(xì)胞膜，染色結(jié)果以細(xì)胞膜著色＞10%細(xì)胞為陽性。反之為陰性

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組之間蛋白表達(dá)陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，各檢測指標(biāo)與病理參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β－catenin在不同大腸組織中的表達(dá):大腸癌組細(xì)胞膜表達(dá)缺失率顯著高于大腸腺瘤組(P＜0.01)。詳見表1。

表1 β－catenin在不同大腸腫瘤中的表達(dá)［例(%)］

2.2 FXR蛋白在大腸組織中的表達(dá):FXR定位于細(xì)胞膜，沿細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色顆粒連續(xù)性著色，20例正常大腸黏膜組織中FXR均為陽性表達(dá)，腺瘤和腺癌組織中陽性率分別為73.3%、43.3%，腺癌組織中FXR的表達(dá)顯著低于腺瘤，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。

表2 FXR在不同組織中的表達(dá)

2.3 大腸癌組織β－catenin與FXR表達(dá)的關(guān)系:FXR與βcatenin表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)(P＜0.001)。詳見表3。

表3 大腸癌中FXR與β－catenin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

大腸癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤，而大腸腺瘤是一種有可能會發(fā)生癌變的良性腫瘤。1990年有學(xué)者提出大腸癌發(fā)生的分子模型［6］，提示大腸癌的發(fā)生機(jī)制在于:正常黏膜上皮發(fā)展形成早期腺瘤，再發(fā)展到中期腺瘤，過渡到晚期腺瘤，最終轉(zhuǎn)變?yōu)榻櫺园?，再發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個(gè)復(fù)雜過程。在這個(gè)過程中會牽扯到許多癌基因、抑癌基因和信號通路的改變。臨床上有學(xué)者認(rèn)為，β－catenin和其通路相關(guān)基因的改變與大腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展之間存在著一定聯(lián)系。β－catenin基因性質(zhì)屬于一種原癌基因，β－catenin蛋白是一種多功能蛋白，β－catenin的作用涉及到兩個(gè)方面，一方面β－catenin是細(xì)胞間粘附連接的主要結(jié)構(gòu)成分，另一方面β－catenin是Wnt信號通路的中樞成分。通路發(fā)生異常的原因在于:胞漿內(nèi)游離的β－catenin增加，與Tcf－4密切結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)入核內(nèi)，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，使得腫瘤生長程序開始運(yùn)行［7－8］。

本試驗(yàn)對大腸癌、大腸腺瘤、正常大腸黏膜組織進(jìn)行了對比研究，結(jié)果證明，正常大腸黏膜β－catenin表達(dá)全部定位于細(xì)胞膜上，沒有見細(xì)胞核表達(dá)。而大腸腺瘤、大腸癌組織中β－catenin的異常表達(dá)普遍存在，且在近些年來有越來越高的趨勢，尤其是大腸癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞漿異位表達(dá)有大幅度增加，細(xì)胞膜表達(dá)缺失程度不同。大腸癌組織β－catenin異位表達(dá)率與大腸腺瘤β－catenin異位表達(dá)率比較，有明顯高出(P＜0.05)。大腸癌組織β－catenin細(xì)胞膜表達(dá)缺失率顯著高于大腸腺瘤(P＜0.01)。

Hao等用免疫組化方法對大腸腺瘤、瘤旁正常黏膜和腺瘤癌變對比研究時(shí)發(fā)現(xiàn)［9］，β－catenin的膜表達(dá)下降和核表達(dá)增加與大腸腺瘤向腺癌轉(zhuǎn)變有關(guān)，是大腸癌發(fā)生的早期事件。Brabletz等檢測了88例大腸腺瘤β－catenin的表達(dá)［10］，結(jié)果表明，有40例腺瘤為細(xì)胞核表達(dá)陽性(45.4%)，同時(shí)細(xì)胞核表達(dá)與大腸腺瘤的大小呈正相關(guān)，結(jié)果充分證實(shí)了β－catenin的異常表達(dá)在大腸腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用。

膽汁酸(BA)是人體膽固醇的代謝產(chǎn)物，在機(jī)體對脂肪和脂溶性維生素的攝取過程中作用顯著。大部分膽汁酸在遠(yuǎn)端回腸被重新吸收，通過門靜脈血流回到肝臟，完成膽汁酸的“肝腸循環(huán)”。肝腸循環(huán)在正常的機(jī)體中每天完成次數(shù)為4～10次［11－12］。法尼醇衍生物X受體(FXR)由Forman在大鼠肝cDNA文庫中分離［13］，他最初被認(rèn)為是中間代謝產(chǎn)物法尼酯衍生物的受體并由此得名。到1999年，F(xiàn)XR被發(fā)現(xiàn)是膽汁酸的核受體，起到了膽汁酸代謝過程中特異性生物感受器的作用［14］。

大量臨床研究結(jié)果表明，膽酸與結(jié)腸癌的發(fā)生之間有一定的關(guān)系，換一種說法，攝入高脂飲食有可能會導(dǎo)致結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌發(fā)生。Wang等的研究表明［15］，小腸刷狀緣鈉鹽依賴的膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)的多態(tài)性與結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生有關(guān)。FXR基因的靜默或低表達(dá)是腫瘤細(xì)胞殘存，腫瘤細(xì)胞凋亡減少和腫瘤生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

在筆者的試驗(yàn)中，用免疫組化方法檢測FXR在大腸腫瘤中的表達(dá)，與正常大腸黏膜相比，F(xiàn)XR在大腸腺瘤的陽性率為73.3%，大腸癌的陽性率為43.3%，大腸癌比大腸腺瘤的表達(dá)明顯下降。可以推測FXR和Wnt通路之β－catenin可能參與了大腸癌的發(fā)病過程和機(jī)制。FXR和β－catenin可以指導(dǎo)大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，為判斷大腸癌的分化、分期提供一定的思路。FXR表達(dá)的缺失可以激活Wnt通路進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。肥胖患者體內(nèi)膽汁酸增多抑制了FXR的活化，進(jìn)而刺激Wnt通路關(guān)鍵信號分子而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。FXR和βcatenin可以成為大腸癌早期診斷、監(jiān)測和預(yù)后判斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。

［1］ Keith A，Wharton Jr.Runnin’with the Dvl:proteins that associate with Dsh/Dvl and their significance to Wnt signal trans duction［J］.Developmental Biology，2003，253(1):1.

［2］ Salahshor S，Woodgett JR.The links between axin and carcinogenesis［J］.Clinical Pathology，2005，8(3):225.

［3］ Takahashi M，Tsunoda T，Seiki M，et al.Identification of membrane－typematrixmetalloproteinase－1 as a targetof the beta－catenin/Tcf4 complex in human colorectal cancer［J］.Oncogene，2002，21(38):5861.

［4］ Miller JR，Hocking AM，Brown JD，et al.Mechanism and function of signal transduction by the Wnt/beta－catenin and Wnt/Ca2+pathways［J］.Oncogene，1999，18(55):7860.

［5］ Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al.Cytoplasmic beta－catenin accumulation as a predictor of hematogenousmetastasis in human colorectal cancer［J］.On－cology，2000，59(4):302.

［6］ Fearon R，Vogelstein.A geneticmodel for colorectal tumorigenesis［J］.Cell，1990，61(5):759.

［7］ Giles RH，van－Es JH，Clevers H.Caught up in a Wnt storm:Wnt signaling in cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2003，1653(1):1.

［8］ Moon RT，Bowerman B，Boutros M，et al.The Promise and perils ofWnt signaling through bata－catenin［J］.Science，2002，296(5573):1644.

［9］ X Hao，I Tom linson，M Ilyas，et al.Reciprocity between membranous and nuclear expression of beta－catenin in colorectal tumours［J］.Virchows－Arch，1997，431(3):167.

［10］ Brabletz T，Herrmann K，Jung A，et al.Expression of nuclear beta－catenin and c－myc is correlated with tumor size but notwith proliferative activity of colorectal adenomas［J］.Am J Pathol，2000，156(3):865.

［11］ Zimber A，Gespach C.Bile acid and derivatives，their nuclear repoters FXR.PXR and ligands:role in health and disease and their therapeutic potential［J］.Anticancer Med Chem，2008，8(5):540.

［12］ Chiang JY.Bile acids:regulation of synthesis［J］.J Lipid Res.2009，50(10):1955.

［13］ Forman BM，Goode E，Chen J，etal.Identification of a nuclear receptor that is activated by farnesol metabolites［J］.Cell.1995，81(5):687.

［14］ Makishima M，Okamoto AY，Repa JJ，et al.dentification of a nuclear receptor for bile acids［J］.Science，1999(284):1362.

［15］ Wang W，Xue S，Ingles SA，et al.An association between genetic polymorphisms in the ileal sodium－dependent bile acid transporter gene and the risk of colorectal adenomas［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001，10(9):931.