白伊娜，宋　寧，胡朝軍，李　萍，李麗君，鄧垂文，史艷萍，鄭文潔，趙　巖，曾小峰，張奉春，李永哲

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科 風濕免疫病學教育部重點實驗室，北京 100032)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性、多關節(jié)為主要表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫病。RA發(fā)病隱匿，致殘率高，早期診斷及早期治療對于預防骨和軟骨的破壞、保護關節(jié)功能尤為重要。1987年美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)制定了RA的分類標準，該標準規(guī)定類風濕因子(rheumatoid factor，RF)為血清學標志物。由于此標準對RA的早期診斷價值有限，隨著免疫學檢驗技術的發(fā)展，2009年ACR與歐洲抗風濕病聯(lián)盟(European League Against Rheumatism，EULAR)共同制定了RA分類的新標準，將抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體列為新的血清學標志物[1]。由此可見，RA相關自身抗體譜的檢測及自身抗體檢測的準確性對于RA的早期診斷非常重要。目前，我國還沒有RA相關自身抗體室間質評，本文的研究結果有助于了解國內RA相關自身抗體的檢測現(xiàn)狀。

2010年，由北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科牽頭組織了200余家醫(yī)院共同參與了實驗室室間自身抗體檢測比對工作。其中包括100余家系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)“十一五”支撐項目臨床干預及注冊研究中國系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究協(xié)作組(Chinese SLE Treatment And Desearch Group，CSTAR)醫(yī)院實驗室，另外的100余家實驗室包括中華風濕病學會委員單位、省級三甲醫(yī)院，參與項目單位覆蓋了全國30個省市自治區(qū)。自身抗體檢測實驗室包括檢驗科實驗室、風濕科實驗室、中心實驗室、獨立實驗室及企業(yè)實驗室等。

材料和方法

比對樣本

抗CCP抗體、RF、抗角蛋白抗體(anti-keratin antibodies，AKA)、抗核周因子抗體(antiperinuclear factor，APF)比對品各5支，均為人血清制備，由北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科實驗室提供。

比對品發(fā)放

由北京協(xié)和醫(yī)院向參與醫(yī)院實驗室寄發(fā)比對品，各參比實驗室在規(guī)定時間內檢測，并將結果回報。

檢測方法

各參比實驗室可采用間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IFA)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)、免疫滲濾層析試驗(膠體金)、免疫比濁法、乳膠凝集試驗(latex agglutination，LA)進行檢測。

實驗方法

各參比實驗室可根據各自現(xiàn)行檢測方法自行選擇上述5種檢測方法對前述4種自身抗體進行定性檢測，所選4種自身抗體根據各實驗室開展的常規(guī)項目檢測。

數據分析

根據回報結果，分別統(tǒng)計自身抗體檢測的正確率及各種檢測方法的正確率。結果分析采用隨機雙盲法，由北京協(xié)和醫(yī)院對各家醫(yī)院檢驗結果進行分析并將結果反饋給各實驗室。

結　　果

項目開展情況

RA相關自身抗體譜參比實驗室檢驗項目構成分別為檢測抗CCP抗體的有138家，檢測RF的有57家，檢測AKA的有77家，檢測APF的有26家。RA相關自身抗體譜檢測項目組合結果：單獨檢測抗CCP抗體為48%，抗CCP抗體+APK+AKA的組合為17%，抗CCP抗體+APF(或AKA)的組合為31%，APF+AKA的組合為1%，單獨檢測APA(或AKA)為3%。

RA相關自身抗體譜檢測方法選擇

參比實驗室檢測RA相關自身抗體譜采用方法統(tǒng)計如下：抗CCP抗體的檢測方法主要為ELISA(96%)，4%為膠體金法檢測。RF的檢測方法主要分為3種，58%的單位用免疫比濁法檢測，23%為ELISA檢測，19%為LA。APF和AKA的檢測方法均為IFA。

檢測結果正確率

抗CCP抗體的準確率最高，陽性或陰性預測值5支比對品的準確率平均為98.6%。RF的5支比對品準確率平均為95.3%。AKA及APF的平均檢測準確率分別為73.4%及79.2%(表1～4)。

表1　抗CCP抗體檢測結果正確率Table 1　Correct rates of anti-CCP antibody test results

CCP：環(huán)瓜氨酸肽；RA：類風濕關節(jié)炎

表2　RF檢測結果正確率Table 2　Correct rates of RF test results

RF：類風濕因子；RA：類風濕關節(jié)炎

表3　AKA檢測結果正確率Table 3　Correct rates of AKA test results

AKA：抗角蛋白抗體；RA：類風濕關節(jié)炎

表4　APF檢測結果正確率Table 4　Correct rates of APF test results

APF：抗核周因子抗體；RA：類風濕關節(jié)炎

方法學評價

在RA相關自身抗體譜參比實驗室中，抗CCP抗體和RF不同檢測方法的正確率見表5、6。

討　　論

1922年，Kurt Meyer首次描述了一種能促進亞凝集劑量兔抗體致敏的綿羊紅細胞發(fā)生凝集反應的因子，幾年后Waaler發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象與抗γ球蛋白抗體有關[2]。因該抗γ球蛋白抗體多發(fā)現(xiàn)在RA患者的血清中而命名為“類風濕因子”。隨著進一步的研究發(fā)現(xiàn)，RF是診斷RA的重要血清學標志，其陽性率可高達80%[3]，但RF還可見于其他疾病及健康人群。高效價的RF是RA的危險因子，可提示疾病活動。1964年，Nienhuis和Mandema[4]發(fā)現(xiàn)了一種抗人頰黏膜上皮細胞質內透明角質顆粒的抗體APF。1979年，Young等[5]報道了抗鼠食管上皮的角質層抗體對RA診斷的特異性。1998年，Schellekens等[6]通過結合包含瓜氨酸的抗原決定簇發(fā)現(xiàn)了抗CCP抗體對于RA的診斷具有特異性，并首次采用ELISA進行抗CCP抗體檢測用于輔助診斷RA[7]。APF及AKA在診斷RA時特異性高，可達70%～99%，但敏感性差，只能達到30%～60%[8-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，APF及AKA的靶抗原為絲集蛋白，該抗原位點用于合成CCP，所以也有學者認為抗CCP抗體是以上兩種自身抗體共同靶抗原位點，可以替代APF及AKA[8,10-11]。

表5　抗CCP抗體不同檢測法的正確率Table 5　Correct rates of anti-CCP antibody detection in different method

CCP：環(huán)瓜氨酸肽；RA：類風濕關節(jié)炎

表6　RF不同檢測方法的正確率Table 6　Correct rates of RF detection in different method

RF：類風濕因子；RA：類風濕關節(jié)炎

RA相關自身抗體的發(fā)現(xiàn)使RA早期診斷及早期治療變成現(xiàn)實。RA的早期臨床表現(xiàn)往往僅為關節(jié)滑膜炎，而關節(jié)滑膜炎只有少部分會發(fā)展為RA。因此，早期診斷不能只依靠臨床表現(xiàn)。然而，在RA典型癥狀發(fā)作的前幾年，患者體內就已經產生了自身抗體。研究發(fā)現(xiàn)，抗CCP抗體可以出現(xiàn)在疾病發(fā)作的幾年甚至十幾年前[12]。RA相關自身抗體是RA早期診斷的關鍵指標，一旦診斷可迅速進行早期治療，以便更好地預防骨關節(jié)的侵襲破壞。由此，檢測RA相關自身抗體的準確性直接影響了RA患者的診斷、治療及預后。

本次比對結果分析顯示，抗CCP抗體的準確率最高，無論是陽性或陰性預測值的準確率都高于97.0%?？笴CP抗體一代抗原為直線性瓜氨酸鈦。2000年，Schellkens等[7]成功合成了含有二硫鍵的CCP，從而克服了一代抗原易被聚苯乙烯吸收及結構不穩(wěn)定的缺點，提高了該抗體檢測的敏感性與特異性。ELISA也成為目前抗CCP抗體最常用的檢測方法。隨著近十年來的不斷發(fā)展，試劑盒的質量不斷完善提高，逐漸采用酶標儀判讀檢測結果，減少了人為因素的影響。本次比對抗CCP抗體各醫(yī)院的檢測結果準確。

RF是RA相關自身抗體中最早且最廣泛應用于臨床檢測的實驗項目，在我國RF檢測在RA相關自身抗體中也是開展最早，因此RF檢測的技術和試劑質量都已經很成熟。本次比對發(fā)現(xiàn)回報結果較少，對此現(xiàn)象進行的調查發(fā)現(xiàn)，由于本次比對品血清量相對較少且運輸過程中出現(xiàn)損耗，一些醫(yī)院采用上機檢測需要血清量大所以未能完成檢測。本次比對結果中RF的準確率較高，5支比對品準確率均高于94.0%。

本次比對結果分析中發(fā)現(xiàn)，APF及AKA的準確率相對較低，其中用于AKA檢測中的1個比對品的檢測準確率僅為51.9%。分析原因，這兩種抗體的檢測方法均為IFA，檢測結果需要通過人眼在熒光顯微鏡下進行觀察判斷。熒光顯微鏡的熒光強弱有所差異，各實驗室無法統(tǒng)一；另外，由于結果為人為操作，增加了主觀因素，存在水平差異，這些都影響了APF及AKA檢測的準確性。各醫(yī)院均應根據自身原因發(fā)現(xiàn)檢測中的問題，及時進行自診。

本次比對的參與醫(yī)院級別主要為三級醫(yī)院，所占比例為96%，二級醫(yī)院僅有11家。為促進自身免疫病規(guī)范化診療技術在全國推廣普及，全面掌握RA相關自身抗體的檢測水平，更深入了解我國自身抗體檢測現(xiàn)狀，今后比對工作的開展需要進一步完善和改進，邀請更多醫(yī)院尤其是二級醫(yī)院參加。

[1]Neogi T, Aletaha D, Silman AJ, et al. The 2010 American College of RheumatologyEuropean League against Rheumatism classification criteria for rheumatoid arthritis: phase 2 methodological report[J]. Arthritis Rheum, 2010,62:2582-2591.

[2]Waaler E. On the occurrence of a factor in human serum actiwating the specific agglutination of sheep blood corpuscules[J]. Acta Patbol Microbiol Scand, 1940,1：172-188.

[3]Doner T, Egerer Keist E, Burmester GR. Rheumatoid factor revised[J]. Curr Opin rheumatol, 2004,16:246-253.

[4]Nienhuis RL, Mandema E. A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis; The antiperinuclear factor[J]. Ann Rheum Dis, 1964, 23:302-305.

[5]Young BJ, Mallya RK, Leslie RD, et al. Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis[J]. Br Med J, 1979,2:97-99.

[6]Schellekens GA, de Jong BA, van den Hoogen FH, et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies[J]. J Clin Invest ,1998, 101:273-281.

[7]Schellekens GA, Visser H, de Jong BA, et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide[J]. Arthritis Rheum, 2000, 43:155-163.

[8]Agrawal S, Misra R, Aggarwal A. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: association with severity of disease in established RA[J]. Clin Rheumatol, 2007, 26:201-204.

[9]PoulsomH, Charles PJ. Antibodies to citrullinated vimentin are a specific and sensitive marker for the diagnosis of rheumatoid arthritis clinic[J]. Rev Allerg Immunol, 2008, 34:4-10.

[10] Szekanecz Z, Soos L, Szabo Z, et al. Anti-citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: As good as it gets?[J]. Clinic Rev Allerg Immunol, 2008, 34:26-31.

[11] Zhao J, Liu X, Wang Z, et al. Is it necessary to combine detection of anticitrullinated protein antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis?[J]. J Rheumatol, 2010, 37:2462-2465.

[12] Barra L, Pope J, Bessette L, et al. Lack of seroconversion of rheumatoid factor and anti-cyclic citrullinated peptide in patients with early inflammatory arthritis: a systematic literature review[J]. Rheumatology, 2011, 50:311-316.