朱建國，林 源，李本強

(上海交通大學 農業(yè)與生物學院 上海市獸醫(yī)生物技術重點實驗室，上海200240)

0 引 言

抗體(Antibody)是疾病治療診斷中最有力的工具之一，也是迄今為止檢測和治療分子中發(fā)展最快的一類功能性分子?；蚬こ碳夹g已經將抗體研制技術推向第三代基因重組抗體階段［1］。其中的單鏈抗體(Single-chain variable fragment，scFv)由于具有分子量小、易于基因操作改造、在特定醫(yī)學應用中擁有多種有利性質、便于經濟有效的生產等特點，顯示出比傳統單克隆抗體(mAb)更大的優(yōu)勢，是第三代抗體的重要代表［2］，其相關的理論和技術也應該是生命科學學科領域學生重點掌握的知識。

“動物生物技術綜合實驗II”是一門涵蓋以現代免疫學、分子生物學等學科原理和技術為基礎的動物疫病綜合防治技術實驗課程。該課程中的一些實驗內容在教學過程中被證明設置不科學或與其他課程內容重復，需要設置更為科學合理的實驗內容對其進行更新。

本課題組多年來一直從事單鏈抗體技術研究，成功構建了單鏈抗體庫，并篩選得到了多個針對傳染性支氣管炎病毒(IBV)以及新城疫病毒(NDV)等的單鏈抗體［3］。隨著研究的深入，我們也發(fā)現了單鏈抗體構建技術中的一些新問題，譬如抗體分子親和力不高、穩(wěn)定性較差等。這些是書本上找不到現成解決方法的共性問題［4］，需要在實驗中引導學生探索研究新的解決方法。為此，我們申報上海交通大學特色實驗項目“改善單鏈抗體親合力的分子結構改造”，目的是在本科生所能承受的技術層面內，研究制定切實可行的實驗內容和方案，替代現有的設置不科學的實驗課內容，以期通過實驗，使學生掌握抗體分子結構與其親合力的關系的基本原理以及通過結構改造改善抗體分子功能的基本技術［5］。這將對增強學生對生物技術的好奇心和興趣，啟發(fā)學生科研創(chuàng)新意識，培養(yǎng)學生的科研能力發(fā)揮重要的作用。

1 實驗目的

通過實驗，讓學生掌握抗體分子結構與其親合力的關系的基本原理，掌握氨基酸置換對抗體片段親和力影響的基本原理以及PCR 點突變、基因堿基置換的基本技術方法［6］，從而對通過結構改造改善抗體分子功能的基本原理和技術有一個全面系統的認識。這將對增強學生對生物技術的好奇心和興趣，啟發(fā)學生科研創(chuàng)新意識，培養(yǎng)學生的科研能力發(fā)揮重要的作用。

2 實驗內容

整個實驗項目由3 個實驗組成，每個實驗安排3學時，共需9 學時。

(1) 實驗一 改善單鏈抗體親和力的置換堿基確定及PCR 引物設計實驗。分析本實驗室構建的單鏈抗體ZL.10 的基因序列，確定為提高抗體親和力需要置換的氨基酸，按照點突變PCR 的原理設計兩對引物［7］，用于對重鏈CDR3 301-303 堿基和307-310 堿基進行突變。

(2) 實驗二 點突變單鏈抗體基因擴增及其重組表達質粒構建實驗。利用引物設計在突變的scFv 基因兩端加入酶切位點(NcoI 和NotI)，通過PCR 擴增法對scFv 基因實施點突變并最終獲得點突變的scFv 基因，分別用限制性內切酶NcoI 和NotI 對scFv 基因和載體質粒進行雙酶切，使其產生相同粘性末端，利用大腸桿菌T4 連接酶，將酶切后的scFv 基因和載體連接［8］。

(3) 實驗三 點突變單鏈抗體表達及親和力測定分析實驗。對含有scFv 的重組表達質粒的陽性克隆進行培養(yǎng)，再加入誘導劑誘導蛋白表達。收集菌體，利用滲透休克法提取細胞周質中的表達的單鏈抗體，用ELISA 實驗檢測表達的單鏈抗體與抗原的結合強度，以分析比較氨基酸置換前后單鏈抗體的親和力［9］。

3 取得的教學效果

(1) 形成一種科研教學動態(tài)運行模式。本項目選題來自本課題組多年來一直從事單鏈抗體技術研究的實際項目。本課題組經過多年的PRP 與本科生科技創(chuàng)新和畢業(yè)設計的教學實踐，在特色實驗教學方面形成了一定的工作積累。在多年的教學和科研相結合的實踐中，我們團隊注重探索由任課老師、博士研究生、碩士研究生和本科生組成的結構合理的科研教學動態(tài)運行模式。通過本項目順利實施，說明我們探索的由科研團對承擔本科教學實驗的運行模式是成功的［10］。

(2) 改善了現有實驗課程的內容。本課題組開設本科生“動物生物技術實驗2”課程，教學效果良好。但隨著課程運行，我們發(fā)現一些實驗內容已經不能適應學科發(fā)展的需要，需要用新的實驗內容替代現有的設置不科學的實驗課內容，本課題組正是基于在該課程教學實踐過程中對課程建設內容的理解和把握，將本實驗項目分為9 個學時合理地鑲嵌在“動物生物技術實驗2”課程中，使得該課程教學效果大為改善。

(3) 全面提高了學生的科學素養(yǎng)及科研能力。實驗方案設計能充分考慮本科生所能承受的技術能力，且有利于激發(fā)學生創(chuàng)新意識和能力。通過這一完整、具體科研項目的科研過程的參與，使學生從科研項目立項可行性論證、實驗方案設計、實驗操作、結果分析討論等環(huán)節(jié)有一個全面系統的體驗和鍛煉［11］，全面提高了學生的科學素養(yǎng)及科研能力。

4 結 語

(1) 驗證性實驗改為探索性試驗，有利于激發(fā)學生的科研興趣和創(chuàng)新意識。在充分考慮學生所能承受的專業(yè)理論和技術能力的前提下，從課題組實際科研項目中需要探索的項目中凝練出一個小型科研項目，擬解決的問題都是書本上找不到現成解決方法的共性問題，需要在實踐中引導學生探索研究新的解決方法。實踐證明，當學生知道他們要做的實驗是探索一種未知的東西時，非常興奮。讓學生實際體驗創(chuàng)新樂趣，更能激發(fā)學生的好奇心和探索精神，對于啟發(fā)學生科研創(chuàng)新意識，培養(yǎng)學生的科研能力具有重要的作用［12］。

(2) 正式實驗和預備實驗相結合，力求完整系統。本實驗是一個系統的小型科研項目，實驗內容完整系統，但由于本科生教學計劃的實際需要，本項目只能安排9 學時，而且分割成三次實驗，每個實驗間隔一周，跨度大，內容不連貫，難以銜接，不利于學生對整個實驗過程的整體把握。所以我們探索出一個正式實驗與預備實驗相結合的運行模式，特別抓預備實驗環(huán)節(jié)［13］。即每次正式實驗開始前，每個小組至少有一個學生提前到實驗室準備實驗，而正式實驗結束后，至少有一個學生負責觀察結果，確保學生前后連貫地熟悉整個實驗過程，由兩個博士生全程擔任助教。這種由任課老師師、博士研究生、碩士研究生和本科生組成的結構合理的科研教學團隊動態(tài)運行模式，對于這類實驗運行特別有效。

(3) 注重考核環(huán)節(jié)，確保教學質量。除了各個環(huán)節(jié)認真把關外，特別注重通過實驗報告考察學生的掌握能力［14］，老師每次都要認真點評上一次的實驗報告，讓學生針對實驗中出現的問題及時進行討論，談實驗體會，能清醒地認識本科生的實驗能力。在方案設計方面能充分考慮學生所能承受的技術能力，既能保證實驗按照預期結果完成，又善于激發(fā)學生創(chuàng)新意識和能力［15］，取得了較好的成績。

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