張英，朱穎，姚拓＊，祁娟，榮良燕

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草 業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 中 —美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭 州730070；2.青海大學農(nóng)牧學院草業(yè)科學系，青海 西 寧810016）

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根際、莖葉，可促進植物生長及對礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和利用，產(chǎn)生促進植物生長的次生代謝物，抑制有害微生物的有益菌類［1］。促生菌包括解磷、固氮和分泌植物激素的微生物；降解農(nóng)藥殘留和有機污染物的根際微生物；預防和控制流行性病原菌對植物侵染的微生物［2］。PGPR能否在植物根際成功定殖，并發(fā)揮其功效，往往受到氣候、土壤性質(zhì)和土著微生物的影響［3］。微生物在田間植物根際并不是單獨存在的，所以在有益微生物資源的開發(fā)利用和微生物肥料的研究中，了解微生物之間的相互作用，將幾種微生物有機地混合在一起培養(yǎng)，能適應(yīng)較廣譜的生態(tài)環(huán)境，增加混合菌株功能的多樣性，并有可能產(chǎn)生優(yōu)于單類菌培養(yǎng)的效果，這對復合微生物肥料的開發(fā)利用有著重要的意義。

近幾年來，一些學者就細菌間的交互促生效果進行了些研究，如Esitken等［4］、Banchio等［5］、Karlidag等［6］、Orhan等［7］將混合接菌劑接種到植物（蔬菜、水果等）根際后發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)植物的營養(yǎng)平衡，促進N、P、K和其他（Mg、Ca、Fe、Mn和Zn）營養(yǎng)元素吸收，促進植物生長，提高植物產(chǎn)量。再次驗證了適合的菌株混合物能起到協(xié)同作用，如一類微生物為另一類微生物的生長提供重要的養(yǎng)料和基質(zhì)，或者為另一類微生物的繼續(xù)生長創(chuàng)造了有利條件，有的甚至依賴于其他微生物而存活［8］，一些可以促進其他細菌生長繁殖［9］。

目前，對具有不同功能的根際PGPR共生協(xié)作效應(yīng)的研究報道較少。本研究擬開展具有固氮、溶磷和分泌植物激素等功能的不同PGPR菌株之間進行單獨和交叉混合培養(yǎng)，測定溶磷和分泌IAA（吲哚乙酸，Indoleacetic Acid）的能力，探討菌株在溶磷和分泌IAA時的互作效應(yīng)，探求不同功能菌株的最佳組合，以期為研制PGPR復合菌肥提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌株為前期（2008－2010年）在蘭州、定西、酒泉及其周邊地區(qū)苜蓿（Medicagosativa）、白三葉（Trifoliumrepens）和紅三葉（Trifoliumpratense）植物根際分離、篩選獲得的細菌（PGPR菌株）（表1），這些菌株具有較強的固氮、溶磷、分泌IAA的能力，同時具有生長快、競爭力強等特點［10－12］。

表1 供試菌株Table 1 Tested strains

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基［13］：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 m L，p H＝7.0。

PKO無機磷培養(yǎng)基［14］：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，Mn－SO40.03 g，F(xiàn)eSO40.003 g，酵母膏0.5 g，瓊脂20 g，Ca3（PO4）23 g，蒸餾水1 000 m L，p H＝6.8～7.0。

蒙金娜有機磷培養(yǎng)基［15］：FeSO4·7 H2O 0.03 g，（NH4）2SO40.5 g，CaCO35 g，NaCl 0.3 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，葡萄糖10 g，卵磷脂0.2 g，酵母膏0.4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 m L，p H＝7.0～7.5。

King培養(yǎng)基［16］：MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.15 g，蛋白胨20 g，甘油15 m L，蒸餾水1 000 m L，p H＝6.8。

Spot比色液［16］：0.5 mol／L FeCl31 m L，蒸餾水50 m L，濃 H2SO430 m L。

S2比色液［16］：FeCl34.5 g，10.8 mol／L H2SO41 L。其測定范圍為5～200μg／m L，一般超過100μg／m L需要稀釋。

1.3 菌株拮抗反應(yīng)測試

菌株間的拮抗反應(yīng)測試采用牛津杯法［17］，將一種菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌懸液，以2%（V／V）的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)48 h；發(fā)酵液8 000 r／min離心10 min，上清過0.22μm濾膜，取濾液100μL滴加在含有2% 另一種細菌的LB平板中央的牛津杯中（直徑7 mm），待發(fā)酵濾液擴散后置28℃條件下恒溫培養(yǎng)。以無菌水作陰性對照。將供試4株細菌兩兩進行抑菌實驗，每個處理3次重復，1 d后觀察抑菌圈的有無，若有抑菌圈，說明兩細菌間有拮抗作用，若無抑菌圈，且細菌生長良好，則說明這兩個細菌可以共存，各菌株間沒有拮抗作用，不發(fā)生拮抗反應(yīng)的菌株可以混合培養(yǎng)，否則只能單獨施用。

1.4 互作實驗設(shè)計

將無拮抗反應(yīng)的4株供試菌株，在LB培養(yǎng)液中，于28℃，125 r／min振蕩培養(yǎng)48 h后，待菌株充分生長后，用無菌水調(diào)節(jié)各待測菌株菌懸液濃度為1×108cfu／m L（波長660 nm，OD值≥0.5）。將制備好的菌懸液按表2的方法處理，共16個處理。

1.5 各處理菌株溶磷能力測定

將50 m L液體PKO無機磷培養(yǎng)液和蒙金娜有機磷培養(yǎng)液分別裝入150 m L三角瓶中，121℃滅菌25 min，冷卻后按處理設(shè)計分別接種500μL菌懸液，每個處理設(shè)3次重復。接種完后，將三角瓶置于28℃、160 r／min搖床培養(yǎng)10 d，之后加入已處理的活性炭1 g，振蕩30 min（150 r／min）。再將培養(yǎng)液在10 000 r／min、4℃離心15 min，取上清液，用鉬銻抗比色法測定有效磷增量（扣除對照后的值，mg／L）［18］，計算公式如下：

其中：P—有效磷增量；K—從標準曲線查得顯色液的磷含量（mg／L）；V—顯色時溶液定容的體積（m L）；V1—顯色時吸取上清液的體積（m L）。

1.6 各處理菌株培養(yǎng)液p H值變化測定

用酸度計測定1.5中培養(yǎng)10 d后的各處理菌株培養(yǎng)液p H值的變化情況。

1.7 各處理菌株分泌有機酸總量測定

取1.5中離心后的上清液，以酚酞為指示劑，用0.1 mol／L NaOH滴定各上清液，測定有機酸的總量，用 mmol／L表示。

1.8 菌株分泌IAA能力測定

1.8.1 定性測定 將50 m L King培養(yǎng)液裝于150 m L三角瓶，121℃滅菌25 min，冷卻后按處理設(shè)計分別接種500μL菌懸液，每個處理設(shè)3次重復。接種后，將上述三角瓶置于28℃，150 r／min搖床培養(yǎng)12 d，吸取菌株培養(yǎng)液50μL滴置于白色陶瓷板上，同時加50μL Spot比色液，對照只在比色液中加50 μL 10 ppm的植物生長激素（3－吲哚乙酸）；將白色瓷板置室溫下，在15 min內(nèi)觀察其顏色變化，顏色變粉紅者表示能分泌IAA，顏色越深表示分泌IAA能力越強；不變色為陰性，即不分泌IAA。

1.8.2 定量測定 采用Salkowski比色法［19］，吸取1.8.1中培養(yǎng)12 d菌株培養(yǎng)液10 000 r／min、4℃離心10 min，取上清液1 m L加1 m L S2比色液在黑暗下靜置30 min后，迅速用分光光度計比色（波長530 nm）進行測定（標準曲線采用純的3－吲哚乙酸制作）。

表2 菌懸液的處理Table 2 Bacteria levitation liquid treatments

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株拮抗反應(yīng)測試

微生物間的拮抗作用，一般是指一種微生物的生命活動或其代謝產(chǎn)物，抑制或干擾另一種微生物生命活動的現(xiàn)象。拮抗試驗是鑒定菌株間遺傳差異的傳統(tǒng)方法，是其不同遺傳特性和親和群的重要表現(xiàn)［20］。本研究供試菌株間拮抗反應(yīng)測試結(jié)果表明菌株間均無拮抗反應(yīng)，可用于制作混合接種液。

2.2 各處理菌株的溶磷能力

2.2.1 溶解無機磷能力 以PKO無機磷培養(yǎng)基中磷酸三鈣為唯一磷源，對各處理的有效磷增量進行了測定，結(jié)果表明，單菌株處理有效磷增量為14.68～307.61 mg／L，各處理有效磷增量差異顯著（P＜0.05）（表3），其中C處理的有效磷增量最大，為307.61 mg／L；2菌株組合處理中，AD處理的有效磷增量最大，為536.26 mg／L，另外，AB、AD、BC、BD處理的有效磷增量均顯著高于單菌株處理的有效磷增量，且大于2菌株單獨接種時有效磷增量之和（P＜0.05），呈現(xiàn)“1＋1＞2”的溶磷效果，而AC、CD處理的有效磷增量均顯著高于單菌株處理的有效磷增量，但均未表現(xiàn)“1＋1＞2”的溶磷效果；3菌株和4菌株組合處理中除ABD處理外，其余各處理的有效磷增量均顯著高于單菌株處理的有效磷增量，但均未表現(xiàn)“1＋1＋1＞3”或“1＋1＋1＋1＞4”的溶磷效果。說明沒有拮抗作用的各菌株混合培養(yǎng)，大部分組合能顯著提高有效磷的增量，但所起到的作用也不完全是加成效應(yīng)。

2.2.2 溶解有機磷能力 有機磷是土壤中磷元素的重要來源之一，約占土壤中全部磷元素的30%～50%。因此微生物對有機磷的轉(zhuǎn)化也是土壤中磷元素的重要來源。本研究中各處理菌株都具有一定的溶解有機磷能力（表4），有效磷增量總體不高，為2.50～11.11 mg／L，為無機磷有效磷增量的2%，其中：單菌株C處理有效磷增量最小（2.50 mg／L），與其他處理差異極顯著（P＜0.01），D 處理有效磷增量最大（11.11 mg／L），與其他處理差異顯著（P＜0.05）；組合處理BD有效磷增量較D和B處理時低（P＜0.05），組合ACD處理的有效磷增量（9.20 mg／L）較高，但小于單菌株D處理，其余各處理有效磷增量均處于2菌株單獨培養(yǎng)有效磷增量值之間，各組合處理的有效磷增量均沒有表現(xiàn)加成效應(yīng)。說明菌株組合培養(yǎng)，對有機磷的溶磷能力不一定會提高，這可能是菌株溶解有機磷的能力和溶磷機理均與培養(yǎng)的條件等有關(guān)。

2.3 有效磷增量與p H的關(guān)系

p H值是衡量溶液酸堿性的尺度，也是反映微生物溶磷的影響因素之一。各處理菌株培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液p H值都明顯降低，且較對照差異顯著（P＜0.01）。在PKO培養(yǎng)液中有效磷增量大于400 mg／L的4個處理的p H值集中于3.16～4.61（表3），在蒙金娜培養(yǎng)液中有效磷增量大于8 mg／L的6個處理的p H值集中于5.74～6.77（表4），說明各處理菌株在培養(yǎng)的過程中均能分泌一些酸類物質(zhì)使p H值降低。對PKO和蒙金娜培養(yǎng)液有效磷增量與p H值間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，PKO 培養(yǎng)液的Y有效磷增量＝－125.77XpH＋908.75（R2＝0.525 7），有效磷增量與p H間呈線性相關(guān)（圖1）（P＜0.01）；蒙金娜培養(yǎng)液的Y有效磷增量＝－4.0305XpH＋32.851（R2＝0.282 4），有效磷增量與p H間也呈現(xiàn)線性相關(guān)（圖2）（P＜0.05），說明培養(yǎng)液p H值降低對各處理菌株溶磷作用存在一定的相關(guān)性。

表3 各處理菌株在PKO培養(yǎng)液中有效磷增量、p H值及有機酸總量的變化Table 3 Available increased phosphorus，p H and total organic acid on PKO culture medium by different treatments

2.4 有效磷增量與有機酸總量的關(guān)系

許多微生物在生命代謝活動中常常會分泌有機酸，測定各處理菌株培養(yǎng)液的有機酸總量（表3），結(jié)果表明，處理菌株在PKO培養(yǎng)液中生長10 d后均能分泌有機酸，各處理與對照（1.13 mmol／L）差異顯著，有機酸總量為8.53～20.33 mmol／L，其中 A處理有機酸總量最高，為20.33 mmol／L，ABCD處理有機酸總量次之，為18.33 mmol／L。分析有機酸總量與培養(yǎng)液有效磷增量間的相關(guān)性表明，Y有效磷增量＝19.485X有機酸總量＋64.127（R2＝0.337 3），培養(yǎng)液有效磷增量與有機酸總量間呈線性相關(guān)（圖3）（P＜0.05），但相關(guān)性較弱。A處理的有機酸總量最高，但有效磷增量（283.17 mg／L）并非最高，而ABCD處理有機酸總量次之，有效磷增量（412.26 mg／L）卻高于A處理129.1 mg／L。其結(jié)果表明有效磷增量與有機酸總量間存在一定的相關(guān)性，但有效磷增量并不完全由總有機酸量來決定，可能也與分泌的有機酸的種類有關(guān)，尤其是多微生物共同作用時，微生物的溶磷機理更加復雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。

圖1 溶磷量與p H值的相關(guān)性（PKO培養(yǎng)液）Fig.1 Relationships between P solubilization and p H value（PKO culture medium）

圖2 溶磷量與p H值的相關(guān)性（蒙金娜培養(yǎng)液）Fig.2 Relationships between P solubilization and p H value（Mongolia Jin culture medium）

2.5 有機酸總量與p H的關(guān)系

微生物生命活動過程中會分泌有機酸，但有機酸的種類較復雜，菌株培養(yǎng)過程中分泌的有機酸是否對培養(yǎng)液p H值的降低起決定作用，對各處理在PKO培養(yǎng)液中的有機酸總量與p H值（表3）進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，YpH＝－0.1817X有機酸總量＋7.174 8（R2＝0.889 4），p H值的變化與有機酸總量間相關(guān)性顯著（P＜0.01）（圖4）。A 處理有機酸總量最高（20.33 mmol／L），培養(yǎng)液的p H 值（3.95）較對照CK（7.21）顯著降低，但并非最低，而ABCD處理有機酸總量次之（18.33 mmol／L），培養(yǎng)液的p H 值（3.16）最低。結(jié)果表明有機酸總量與p H值的變化存在線性相關(guān)，這可能與菌株分泌的有機酸的種類和數(shù)量有關(guān)，另外可能與菌株協(xié)同作用的影響也有一定的關(guān)系。

表4 各處理菌株在蒙金娜培養(yǎng)液中有效磷增量和p H值的變化Table 4 Available increased phosphorus and p H on Mongolia Jin culture medium by different treatments

2.6 各處理菌株分泌IAA能力

測定各處理菌株分泌IAA的結(jié)果可知（表5），Spot試劑比色測定，除D處理顏色基本沒有變化外，其他處理均有顏色變化，說明除D處理，其他各處理都能分泌一定量IAA，進一步用S2試劑定量測定，其結(jié)果與采用Spot試劑基本一致，各處理差異顯著（P＜0.05），各處理分泌IAA 量為0.212～9.331 μg／m L。單菌株B處理顏色變化較明顯，分泌IAA量也最高（9.331μg／m L）。組合處理菌株分泌IAA量差異顯著，其中：BD處理分泌IAA量較高（9.152μg／m L），AD處理分泌IAA量（6.887μg／m L）較菌株A處理分泌IAA量（3.624μg／m L）和D處理分泌IAA量（0.212 μg／m L）顯著提高（P＜0.01），且表現(xiàn)出“1＋1＞2”的加成效果，其他菌株組合處理，分泌IAA量在2菌株單獨培養(yǎng)時分泌IAA量之間。說明菌株混合培養(yǎng)，不一定都能提高某種菌株分泌IAA的活力，組合菌株分泌IAA能力可能與多種因素有關(guān)。

圖3 溶磷量與有機酸總量的相關(guān)性（PKO培養(yǎng)液）Fig.3 Relationships between P solubilization and organic acids（PKO culture medium）

圖4 p H值與有機酸總量的相關(guān)性（PKO培養(yǎng)液）Fig.4 Relationships between p H value and organic acids（PKO culture medium）

3 討論

Glick［21］和 Bashan等［22］認為用植物促生菌菌劑接種植物是一種有效促進植物生長、提高作物產(chǎn)量的方法，PGPR可通過各種代謝途徑來促進植物生長，如固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素、合成鐵載體或提高對植物病原菌的生物控制等。以往對PGPR的分離、篩選和固氮、溶磷能力等功效的測定，優(yōu)良菌株的種類鑒定，研制單菌株接菌劑，并對植物生長特性和品質(zhì)的影響等方面開展了大量的研究，取得了一定的成果［23，24］。近年來，有些學者研究了混合接種劑對植物的促生作用，結(jié)果表明對植物的促生作用效果顯著，如Esitken等［4］采用PseudomonasBA－8和BacillusOSU－142菌株，單獨和混合接種歐洲甜櫻桃（Prunusavium），結(jié)果表明，樹干的橫斷面積增加，甜櫻桃的重量增加，嫩枝條長度增加，并使葉片中的N、P、K、Fe、Mn和Zn的含量增加。Orhan等［7］采用BacillusM3和BacillusOSU－142混合接種劑接種木莓（Rubusswinhoei），產(chǎn)量增加74.9%，莖長增加15.0%，葉片中的N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn和Zn含量增加，土壤中有效磷的含量從1.55 mg／kg增加到4.71 mg／kg。Karlidag等［6］采 用BacillusM3、BacillusOSU－142 和MicrobacteriumFS01菌株，單獨和混合接種蘋果（Malus domestica）5年后，產(chǎn)量增加26.0%～88.0%，水果重量增加13.9%～25.5%，枝條長度增加16.4%～29.6%，枝條直徑增加15.9%～18.4%。PGPR菌株單獨和混合接種都能促進植物的生長和產(chǎn)量的增加，但混合接種的效果更好。植物根際存在有益菌群的同時，也存在許多病原菌［25－28］，使得植物產(chǎn)量降低，造成了經(jīng)濟損失，目前，生防菌劑的研究與應(yīng)用逐步成為熱點，本研究中所用菌株對病原菌的生防性能有待進一步研究。

表5 各處理在King培養(yǎng)基分泌IAA濃度Table 5 Concentration of IAA secrete from treatments bacteria on King culture

本研究對4株優(yōu)良PGPR菌株進行不同組合處理，測定各處理的溶磷能力，有些菌株混合比單菌株表現(xiàn)更好的功效，如本研究的組合AD（Hsg＋lhs11）、ACD（Hsg＋ls1－3＋lhs11）等處理，也有菌株混合后功效降低，如組合CD（ls1－3＋lhs11）等處理。綜合分析各菌株組合溶解無機磷和有機磷結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有優(yōu)良特性的菌株組合處理，并不是都能表現(xiàn)出良好的加成效應(yīng)，也不是組合菌株越多越好，這是因為菌株間交互作用受多種因素綜合的作用：一方面可能是各菌株本身菌體差異較大［29］，多菌株同時接種后，存在營養(yǎng)和空間的競爭；另一方面相對單獨培養(yǎng)，共同培養(yǎng)會導致生理代謝物質(zhì)的差異，不能排除彼此產(chǎn)生的分泌物對其他菌株溶磷效果的抑制作用；第三，磷是微生物生長繁殖的必需營養(yǎng)元素之一，在溶磷菌和固氮菌的培養(yǎng)過程中，將消耗一部分可溶性磷構(gòu)建微生物細胞［30］。同時采用Spot和S2試劑定性、定量測定各處理分泌IAA的能力，除組合AD（Hsg＋lhs11）處理外，大部分菌株組合處理分泌IAA量為2菌株單獨培養(yǎng)時分泌IAA量之間。說明菌株混合培養(yǎng)，可能提高某種菌株分泌IAA的活力，同時抑制另一菌株活力，另外菌株分泌IAA能力與培養(yǎng)環(huán)境及代謝途徑等多種因素有關(guān)，并且，這些菌株分離自不同生境植物根際，當它們混合培養(yǎng)后，可能有一個相互適應(yīng)的過程，或者由于生境的差異，使菌株組合不能表現(xiàn)出良好的促生作用，其相關(guān)的作用機理尚需進一步研究。

微生物溶磷機理非常復雜，有些微生物溶磷主要是質(zhì)子起作用，有些主要是有機酸起作用，而有些菌株則2種機制都存在，還有些菌株由于生長過程中產(chǎn)生其他的螯合物質(zhì)，從而導致磷礦粉的溶解［31］。Narsian和Patel［32］、Illmer和Schinner［33］研究表明溶磷量和培養(yǎng)介質(zhì)p H 值之間缺乏相關(guān)性，但 Paul和Sundara［34］、康貽軍等［35］、馮瑞章等［36］和王光華等［37］報道二者之間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株培養(yǎng)液有效磷增量與p H值、有效磷增量與有機酸總量、有機酸總量與p H值之間都存在線性相關(guān)關(guān)系，表明溶磷菌分泌有機酸的溶磷作用，但溶磷菌把磷酸鹽從難溶狀態(tài)轉(zhuǎn)化為可溶狀態(tài)是一個復雜的過程，并且溶磷菌株之間溶磷機制存在多樣性，溶磷菌溶磷的機理、磷酸酶的作用、釋放H＋的作用、蛋白質(zhì)的作用等有待進一步研究。

篩選出的AD（Hsg＋lhs11）、ACD（Hsg＋ls1－3＋lhs11）組合處理較其他組合處理具有較好的互作協(xié)同作用，表現(xiàn)出良好的互作效能，可作為復合微生物肥料生產(chǎn)的潛在優(yōu)良菌株組合作一步研究，本研究采用的菌株正在進行鑒定，研究這些菌株在植物根際的定殖能力和實際促生效果將成為進一步工作的重點。

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