馮文靜，　徐西振，　趙　剛，　趙俊杰，　董若蘭，　凃　玲△,　姚濟(jì)華△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1老年醫(yī)學(xué)科, 2心內(nèi)科, 湖北 武漢 430030；3山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250021)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一類嚴(yán)重的進(jìn)展性疾病，其主要特征是肺血管阻力進(jìn)行性升高，持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡[1]。肺血管重構(gòu)是肺血管阻力進(jìn)行性升高的重要病理生理基礎(chǔ)，肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖導(dǎo)致了肺動脈中膜的肥厚和肌化，進(jìn)而導(dǎo)致肺部毛細(xì)血管前動脈閉塞和肺動脈壓力持續(xù)升高[2]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)能刺激血管平滑肌細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)肺血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展[3]。

緩激肽(bradykinin, BK)是一種血管活性九肽，通過自分泌-旁分泌機制釋放，與受體結(jié)合后發(fā)揮擴張血管、降低血壓、增加局部血流、調(diào)節(jié)平滑肌松弛和收縮、增加血管通透性等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。研究表明，激肽釋放酶通過增加BK水平從而抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞的增殖[5]，然而，BK是否能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖及其可能的分子機制尚不清楚。因此，本研究聚焦于肺血管重構(gòu)的病理生理機制，旨在探討B(tài)K對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響，為臨床肺血管重構(gòu)的治療提供新的理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1材料

1.1主要試劑 豬肺動脈購自武漢市血清制品廠，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自HyClone。PASMCs培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、0.146 g/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。緩激肽、TGF-β1和緩激肽2型受體(bradykinin type 2 receptor, B2R)抑制劑HOE-140購自Sigma。細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)試劑盒和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購自碧云天生物技術(shù)研究所，BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抗體購自Cell Signaling Technology，小鼠抗β- actin抗體、小鼠抗磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (phosphoylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, p-ERK1/2) 抗體、兔抗ERK1/2抗體、兔抗蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt)抗體和兔抗p-Akt抗體購自Santa Cruz。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠 IgG抗體購自 Jackson Immuno Research Lab。Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑購自Pierce Biotechnology，PVDF膜購自Life Science，其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器Western blotting設(shè)備(Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng)Gene Genius Bio Imaging System(Synegene)，微量紫外分光光度計(Bio-Rad)，超凈工作臺(杭州)，CO2培養(yǎng)箱(Forma)。

2方法

2.1PASMCs原代培養(yǎng)與鑒定 無菌操作下取豬肺動脈，分離肺組織中的3～4級肺小動脈，按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行培養(yǎng)和傳代[6-7]，在倒置相差顯微鏡下，PASMCs融合呈梭形重疊生長，呈現(xiàn)典型的“谷與峰”樣特征。免疫熒光染色顯示抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)陽性，細(xì)胞純度在95%以上，實驗采用第2～6代細(xì)胞進(jìn)行。

2.2實驗分組培養(yǎng)板中的細(xì)胞隨機分為對照組、溶媒組、BK(10-5mol/L)組、TGF-β1(2 μg/L、5 μg/L和10 μg/L)組、TGF-β1+ HOE-140組、TGF-β1+BK組以及TGF-β1+BK+HOE-140組。細(xì)胞生長至60%～70%匯合時，換含0.4%FBS的DMEM培養(yǎng)基同步化處理12 h，換用新鮮DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)處理。為研究可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，給予BK(10-5mol/L)前1 h加用HOE-140(10-5mol/L)，BK干預(yù)作用30 min后，加入TGF-β1，繼續(xù)孵育24 h，進(jìn)行CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況或者提取相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)分析。實驗至少重復(fù)3次。

2.3細(xì)胞活性檢測細(xì)胞活性檢測按文獻(xiàn)所述的方法[8]，用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖情況。用0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)生長期的PASMCs至單個細(xì)胞懸液并接種于96孔板，每孔100 μL，按上述分組和干預(yù)方法給藥，每組設(shè)5個復(fù)孔。實驗結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(避光)，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后在自動酶標(biāo)儀上測定490 nm處吸光度(A490)。

2.4Western blotting檢測相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)Western blotting按文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行，細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后用預(yù)冷的1×PBS洗2次，6孔板每孔加入三去污細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 150 mmol/L NaCl, 0.2 g/L NaN3, 1 g/L SDS, 100 mg/L aproti-nin, 10 g/L NP-40, 5 g/L去氧膽酸鈉, 100 mg/L PMSF)100 μL裂解細(xì)胞。用BCA蛋白定量試劑盒測定細(xì)胞蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)加入6×loading buffer煮沸5 min，冰上靜置4 min上樣， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將分離開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2.5 h，相應(yīng)Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，第2天室溫下TBS-T洗滌Ⅰ抗1 h，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育2.5 h，TBS-T洗滌1 h，ECL試劑顯影，曝光，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)灰度掃描定量各組蛋白質(zhì)的表達(dá)量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間差異顯著性比較應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進(jìn)行One-way ANOVA后，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1PASMCs形態(tài)及鑒定

肺動脈中膜組織塊移植于培養(yǎng)瓶后，培養(yǎng)5～7 d可見少量細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，并逐漸伸展成梭形或長梭形。部分區(qū)域可見PASMCs融合呈梭形重疊生長，呈現(xiàn)典型的“谷與峰”樣特征。免疫熒光染色結(jié)果見圖1，95%以上細(xì)胞抗α-SMA陽性，胞漿顯示綠色熒光標(biāo)記的肌動蛋白結(jié)構(gòu)，胞核呈橢圓形位于細(xì)胞中央被染成藍(lán)色。

Figure 1. Immunofluorescence staining of PASMCs (×200). A: cytoplasmic positive staining for α-SMA; B: nucleus; C: merged image.

圖1PASMCs免疫熒光染色

2TGF-β1呈劑量依賴性地促進(jìn)PASMCs增殖

TGF-β1(2 μg/L、5 μg/L和10 μg/L)刺激PASMCs 24 h后進(jìn)行CCK-8檢測，結(jié)果見圖2。與對照組和溶媒組相比較，TGF-β1(2 μg/L)組對PASMCs增殖無明顯影響，而TGF-β1(5 μg/L)組與TGF-β1(10 μg/L)組顯著促進(jìn)了PASMCs增殖(P<0.05)，并且以TGF-β1(10 μg/L)組更為顯著，因此后續(xù)實驗采用TGF-β1(10 μg/L)進(jìn)行。這些實驗結(jié)果提示TGF-β1呈劑量依賴性地促進(jìn)PASMCs增殖。

3BK通過B2R抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖

PASMCs接受TGF-β1刺激時分別合用BK與B2R抑制劑HOE-140，CCK-8檢測它們對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響，結(jié)果見圖3。與對照組和溶媒組相比較，單獨應(yīng)用BK (10-5mol/L) 對PASMCs的增殖作用沒有顯著影響(P>0.05)，TGF-β1(10 μg/L)可以顯著促進(jìn)PASMCs增殖(P<0.05)。與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖(P<0.05)。而合用B2R抑制劑HOE-140 (10-5mol/L) 后，BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用顯著降低(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)說明BK通過B2R調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用。

Figure 2. Effects of different concentrations of TGF-β1on the proliferation of PASMCs.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group or vehicle group.

圖2不同濃度TGF-β1處理對PASMCs增殖的影響

Figure 3. Effect of bradykinin (BK) on the proliferation of PASMCs induced by TGF-β1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖3BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響

4BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCsPI3K蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比較，溶媒組PI3K蛋白的表達(dá)無明顯改變(P>0.05)，TGF-β1明顯上調(diào)了PI3K的表達(dá)(P<0.05)；與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組PI3K的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(yīng)(P<0.05)，見圖4。

5BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCsp-Akt蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示,與對照組相比較，溶媒組p-Akt蛋白的表達(dá)無明顯改變(P>0.05)，TGF-β1明顯上調(diào)了p-Akt的表達(dá)(P<0.05)；與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組p-Akt的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(yīng)(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. Expression of PI3K protein in PASMCs treated with vehicle, TGF-β1, BK or B2R inhibitor (HOE-140) as indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖4BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCsPI3K表達(dá)的影響

6BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCsp-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比較，溶媒組p-ERK1/2蛋白的表達(dá)無明顯改變(P>0.05)，TGF-β1明顯上調(diào)了p-ERK1/2的表達(dá)(P<0.05)；與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組p-ERK1/2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(yīng)(P<0.05)，見圖6。

討　　論

肺血管重構(gòu)主要包括肺動脈內(nèi)膜損害、中膜肥厚和外膜增厚，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡參與了PAH發(fā)病的重要起始環(huán)節(jié)[10]。Sakao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，凋亡的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子和TGF-β1能刺激血管平滑肌細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)肺血管重構(gòu)。Sturrock等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PAH發(fā)病過程中存在TGF-β1表達(dá)增加并且促進(jìn)了PASMCs增殖。 細(xì)胞實驗證實，TGF-β1可以促進(jìn)PASMCs由G0/G1期進(jìn)入G2/M+S期，從而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展。 動物實驗也發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β1可以降低肺血管重構(gòu)和右心室壓力[2]。本研究應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的豬PASMCs增殖，發(fā)現(xiàn)TGF-β1呈劑量依賴性地促進(jìn)PASMCs增殖，TGF-β1(10 μg/L)作用24 h，可以顯著誘導(dǎo)豬PASMCs增殖，這與文獻(xiàn)報道[2]是一致的，說明TGF-β1誘導(dǎo)PASMCs增殖模型制作成功。

Figure 5. Expression of p-Akt protein in PASMCs treated with vehicle, TGF-β1, BK or B2R inhibitor (HOE-140) as indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖5BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCsp-Akt表達(dá)的影響

Figure 6. Expression of p-ERK1/2 protein in PASMCs treated with vehicle, TGF-β1, BK or B2R inhibitor (HOE-140) as indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖6BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCsp-ERK1/2表達(dá)的影響

本實驗中，CCK-8結(jié)果顯示，TGF-β1組顯著誘導(dǎo)了PASMCs增殖，加用BK后TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用顯著降低，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(yīng)。Western blotting結(jié)果也顯示，BK顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的激活，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)說明BK是通過B2R調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用。

BK是一種血管活性九肽，是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system, KKS)中的重要活性物質(zhì)成分，主要通過自分泌-旁分泌機制釋放，與受體結(jié)合后發(fā)揮擴張血管、降低血壓、增加局部血流、調(diào)節(jié)平滑肌松弛和收縮、增加血管通透性，改善腎功能等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。B2R是一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛表達(dá)于大多數(shù)組織[13]。已有研究報道，重組腺病毒介導(dǎo)的人組織激肽釋放酶基因轉(zhuǎn)染通過B2R抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，B2R抑制劑HOE-140明顯阻斷了BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用，該作用主要是通過阻斷PI3K/Akt和ERK1/2信號通路而實現(xiàn)。

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