鄭德松 李旗 田福玲 劉國榮 陳金銘 馬樹祥 崔建美 王洪彬 李雪青

糖尿病足是糖尿病常見的、嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥之一，局部潰瘍既是糖尿病足的一種臨床主要表現(xiàn)形式，也是糖尿病足恢復(fù)的一大障礙。本研究應(yīng)用消毒愈肌膏對大鼠糖尿病足潰瘍進(jìn)行干預(yù)，觀察基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9，BMP-9)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達(dá)的變化，為糖尿病足的臨床防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對糖尿病足的發(fā)展、維持和預(yù)后形成新認(rèn)識，并在此基礎(chǔ)上開展相應(yīng)的防治措施。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥品

消毒愈肌膏由黃連20 g、黃柏30 g、白芷25 g、甘草60 g、當(dāng)歸10 g、血竭20 g、輕粉20 g、蟲白蠟10 g、紫草10 g、麻油500 g 組成(參照《中國藥典》2005 年版一部，由河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制備)。TGF-β 參照文獻(xiàn)方法，從人血小板中提純鑒定［1］。BMP 參照文獻(xiàn)方法，從牛皮質(zhì)骨中提純鑒 定［2］。焦 碳 酸 二 乙 酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)，TRIzol 試劑購于Invitrogen 公司，RNeasy Mini kitRNA 試劑盒購于QIAGEN 公司，miRCURYTMArray Power 標(biāo)記試劑盒、PhalanxTM 的熱收縮雜交袋及miRCU-RYTM(v.11.0)芯片購于Exiqon 公司，Prime-ScriptTMRT Reagent kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR(Premix ExTaqTM)實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購于TaKaRa 公司，目的基因及內(nèi)參引物均由奧科生物技術(shù)公司合成，GenePix pro V6.0 和AxonGenePix 4000B 芯片掃描分析儀購于美國Axon 公司，NanoDrop(ND-1000)購于摩根生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級Wistar 大鼠80 只，雌雄各半(河北聯(lián)合大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號為SCXKll-00-0010)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥組、BMP-9 對照組、TGF-β1 對照組、模型組，每組20 只。中藥組:在患處外敷消毒愈肌膏無菌油紗條外敷，無菌紗布包扎，每2 天換藥1 次，觀察30 天。BMP-9 對照組:腹腔注射外源性BMP-9，5 μg/kg，每兩天注射一次，觀察30 天。TGF-β1 對照組:腹腔注射外源性TGFβ1，5 μg/kg，每兩天注射一次，觀察30 天。模型組:在患處應(yīng)用無菌鹽水，無菌紗布包扎，每2 天換藥1次，觀察30 天。

1.3 模型制備

［3］，選用Wistar 大鼠飼養(yǎng)28 天后，禁食6 小時(shí)后，以pH=4.2，0.1 mmol/L 的枸櫞酸鈉緩沖液在4℃條件下，鏈脲佐菌素STZ 配成1%溶液，以55.0 mg/kg 的劑量在大鼠空腹時(shí)左下腹注射，注射后第5 天起連續(xù)3 天監(jiān)測空腹血糖，空腹血糖在12.0 mmol/ml 以上者(80 只)入選繼續(xù)造模。選擇大鼠的足背皮膚，用薄鐵片固定，持續(xù)按壓直徑5 mm 的鐵片，每次30 分鐘，每天2 次。按壓后用50%冰醋酸涂抹創(chuàng)面，連續(xù)刺激1 周后形成缺損性皮膚潰瘍大鼠模型。

1.4 檢測指標(biāo)

潰瘍區(qū)組織BMP-9，TGF-β1 含量。

1.5 基因表達(dá)譜檢測

取大鼠足背部潰瘍區(qū)組織標(biāo)本，置液氮中保存。標(biāo)本總RNA 抽提及質(zhì)量檢測:每100 mg 組織標(biāo)本，加入1 ml 的Trizol 提取總RNA，應(yīng)用kitRNA純化總RNA。使用NanoDrop 測定RNA 在分光光度計(jì)260 nm、280 nm 和230 nm 的吸收值，計(jì)算濃度并評估純度。另外，進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察并拍攝，以檢測RNA 純度及完整性。RNA 的標(biāo)記及芯片雜交:采用miRCU-RYTMArray Power 標(biāo)記酶將Hy3TM 熒光基團(tuán)標(biāo)記RNA，得到用于與芯片雜交的熒光探針。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用PhalanxTM 的熱收縮雜交袋將標(biāo)記好的探針和miRCU-RYTM 芯片進(jìn)行雜交。采用AxonGenePix 掃描芯片的熒光強(qiáng)度，使用GenePix pro 進(jìn)行BMP-9，TGF-β1 含量數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BMP-9 和TGF-β1 作為計(jì)量資料，采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

BMP-9 對照組和中藥組中BMP-9 基因表達(dá)明顯增加，與模型組相比有顯著差異(t=12.740，P=0.000;t=3.947，P=0.009)，BMP-9 對照組與中藥組BMP-9 基因表達(dá)相比有顯著差異(t=3479，P=0.03);TGF-β1 對照組和中藥組中TGF-β1 基因表達(dá)明顯增高，與模型組相比有極顯著差異(t=7.024，P=0.000;t=8.193，P=0.009)，TGF-β1 對照組與中藥組相比，TGF-β1 基因表達(dá)無明顯差異(t=0.240，P=0.813)，BMP-9 和TGF-β1 表達(dá)變化呈顯著正相關(guān)(r=0.951，P≤0.000)，見表1。

表1 BMP-9 和TGF-β1 在糖尿病足潰瘍組織表達(dá)，n=20)

表1 BMP-9 和TGF-β1 在糖尿病足潰瘍組織表達(dá)，n=20)

注:與BMP-9、TGF-β1 對照組和中藥組比較aP ＜0.01;與中藥組比較bP ＜0.05，cP ＞0.05

組 別 BMP-9(μg ∕L) TGF-β1(μg ∕L)模型組 83.268±12.36a 698.32±75.12a BMP-9 對照組 206.33±45.32b —TGF-β1 對照組 — 1326.45±401.39c中藥組153.02±33.68 1283.99±312.94

3 討論

本研究中消毒愈肌膏是以《外科正宗》生肌玉紅膏為主方，加上黃連，黃柏，其功用具有解毒消腫、生肌止痛。諸多研究報(bào)道表明TGF-β1 在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的具有積極作用，在組織修復(fù)病理過程中具有調(diào)節(jié)血管和成纖維細(xì)胞增生、間質(zhì)蛋白合成等作用，同時(shí)可以中和抗體的應(yīng)用大大減少了纖維細(xì)胞介質(zhì)對皮膚成纖維細(xì)胞增殖、遷移和膠原收縮的影響［4-6］。另一方面，TGF-β1 可抑制NO/cGMP 信號以確保其對皮膚成纖維細(xì)胞膠原生產(chǎn)的刺激作用，在一定程度上不僅利于創(chuàng)面愈合，而且對于組織疤痕的形成有一定的抑制作用［7-9］。本研究經(jīng)過對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 對照組和中藥組TGF-β1 基因表達(dá)明顯增高，與模型組相比有顯著差異(P ＜0.01)，證明消毒愈肌膏能顯著調(diào)控TGF-β1 表達(dá)水平，間接刺激組織細(xì)胞的分裂增殖，以利于創(chuàng)傷修復(fù)。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，BMP-9 可誘導(dǎo)骨骼肌源性干細(xì)胞的成骨分化，骨骼肌源性干細(xì)胞存在于骨骼肌中，它是一種具有分化為肌細(xì)胞等多種細(xì)胞系能力的細(xì)胞［10-12］。BMP-9 對照組和中藥組BMP-9 基因明顯增加，與模型組相比有極顯著差異(P ＜0.01)，BMP-9 對照組與中藥組BMP-9 基因相比有顯著差異(P ＜0.05)證明消毒愈肌膏能顯著調(diào)控BMP-9表達(dá)水平，間接刺激肌組織細(xì)胞的分裂增殖，以利于創(chuàng)傷修復(fù)。

在消毒愈肌膏干預(yù)下，基因表達(dá)發(fā)生積極的變化，對糖尿病足潰瘍組織愈合提供生物基礎(chǔ)。但消毒愈肌膏成分復(fù)雜、途徑繁多、靶點(diǎn)多樣的特點(diǎn)，基因的變化受到多種因素的影響，這些基因是始動因素還是下游產(chǎn)物，就基因譜表達(dá)本身尚難定論，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步的驗(yàn)證和探討。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 唐康來，楊柳，盧衛(wèi)忠，等．人血小板中TGF-B 的提取純化及鑒定［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21(11):880-884．

［2］ 盧衛(wèi)忠，唐康來，朱慶和，等．TGF-B 和BMP 對胎兔顱骨成骨樣細(xì)胞增殖和分化相互作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中華創(chuàng)傷骨科雜志，2004，6(4):450-452．

［3］ 陳群力，楊五彪，馬靈筠．實(shí)驗(yàn)性糖尿病足大鼠模型的建立［J］．河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，15(1):1-3．

［4］ Schor SL，Ellis IR，Jones SJ，et al．Bistable switch in MSF expression is regulated by the concerted signalling of TGF-β1 and the extracellular matrix［J］．Int J Cancer，2012，130(9):2024-2032．

［5］ Adams DH，Ruzehaji N，Strudwick XL，et al． Attenuation of Flightless I，an act in-remodelling protein，improves burn injury repair via modulation of transforming growth factor(TGF)-betal and TGF-beta3［J］．Br J Dermatol，2009，161(2):326-336．

［6］ Wang JF，Jiao H，Stewart TL，et al． Fibrocytes from burn patientsregulate the activities of fibroblasts［J］． Wound Repair Regen，2007，15(1):113-121．

［7］ Chu AJ，Prasad JK．Up-regulation by human recombinant transforming growth factor beta-1 of collagen production incultured dermal fibroblasts is mediated by the inhibition of nitric oxide signaling［J］．J Am Coll Surg，1999，188(3):271-280．

［8］ Nishimura T，Nishiura T，deSerres S，et al．Transforming growth factor-betal and splenocyte apoptotic cell death after burn injuries［J］．J Burn Care Rehabil，2000，21(2):128-134．

［9］ Yang L，Chan T，Demare J，et al． Healing of burn wounds intransgenic mice overexpressing transforming growth factor-beta1 in the epidermis［J］．Am J Pathol，2001，159(6):2147-2157．

［10］ 李翔，林春陽，邱北溟，等．骨形態(tài)發(fā)生蛋9 誘導(dǎo)骨骼肌源性干細(xì)胞的成骨分化［J］． 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(32):5971-5974．

［11］ Lee JY，Qu-Petersen Z，Cao B，et al． Clonal isolaisolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing［J］．J Cell Biol，2000，150(5):1085-1100．

［12］ Matsumoto T，Cooper GM，Gharaibeh B，et al． Cartilage repair in a rat model of osteoarthritis through intraarticular transplantation of muscle-derived stem cells expressing bone morphogenetic protein 4 and soluble Flt-1［J］． Arthritis Rheum，2009，60(5):1390-1405．