唐璐　孫塑倫　高穎　朱陵群

地黃飲子是滋腎陰、補(bǔ)腎陽、化痰開竅的代表方劑，“治喑痱，腎虛弱厥逆，語聲不出，足軟不用”。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用的地黃飲子加減方是導(dǎo)師孫塑倫教授從中風(fēng)病的病機(jī)出發(fā)，立足腎虛為本，以溫補(bǔ)腎陽為主要治法化裁而成，通過觀察地黃飲子加減方對(duì)大腦中動(dòng)脈線栓(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠血漿下丘腦—垂體—腎上腺軸(hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA)激素水平及其腦組織熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)，探討了缺血性中風(fēng)急性期應(yīng)用溫陽補(bǔ)腎法對(duì)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸的作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1　動(dòng)物及分組

成年SD雄性大鼠30只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司SPF/VAF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(京)2006-0009)。體重(280±10)g。動(dòng)物稱重編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法[1]分為正常組，模型組，地黃飲子組，每組10只。

1.2　MCAO模型制備

模型組與地黃飲子組大鼠以大腦中動(dòng)脈線栓法造模。以10%水合氯醛(0.35mg·kg-1)麻醉后仰臥固定，常規(guī)備皮，沿頸部正中線切開皮膚1.5cm左右，鈍性分離頸部肌群，以開瞼器充分暴露手術(shù)野，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)及頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)，結(jié)扎ECA及CCA近心端，CCA遠(yuǎn)心端穿線備用。動(dòng)脈夾夾閉ECA分叉處。于CCA剪開一個(gè)小口，插入頭端直徑為0.28 mm的栓線。輕輕結(jié)扎固定栓線于CCA內(nèi)，開放動(dòng)脈夾，將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，使其頭端到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處。扎緊固定線，縫合皮膚。術(shù)中用100 W燈泡照射，嚴(yán)格控制室溫?？p合傷口，清理血跡，將術(shù)后大鼠置于電熱毯保持體溫，直至蘇醒。

1.3　藥物制備及灌胃方法

地黃飲子加減方配伍及劑量：熟附片4 g、巴戟天10 g、山萸肉10 g、熟地黃12 g、石斛10 g、肉蓯蓉12 g、五味子6 g、麥冬15 g。按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算，等效比例為7，總生藥量316 g。將所有藥物用10倍量和8倍量的水煎煮2次，每次1小時(shí)，合并水煎液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，制成含生藥1.0 g/ml的藥液備用，pH值7.0。每日稱重，按1 ml/100 g的量連續(xù)灌胃7天，其中地黃飲子組灌胃中藥藥液，模型組和正常組灌胃等量的生理鹽水，于最后一次灌胃后1小時(shí)取材。至取材時(shí)模型組大鼠死亡3只，原因?yàn)樾g(shù)后腹腔感染、灌胃失誤，剩余7只；地黃飲子組大鼠死亡3只，原因?yàn)樾g(shù)后腹腔感染、麻醉過量、灌胃失誤，剩余7只。

1.4　主要試劑

促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放射免疫試劑盒、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)放射免疫試劑盒、皮質(zhì)醇(cortisol，COR)放射免疫試劑盒均由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供。多克隆小鼠抗動(dòng)物HSP70試劑盒，SABC、DAB顯色試劑盒均由博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.5　指標(biāo)檢測

1.5.1血漿HPA軸大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4 ml，注入含30 μl EDTA、40 μl抑肽酶的試管中靜置，4℃ 3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液，存-80℃冰箱備用。通過上海核所日環(huán)光電儀器有限公司Sn-695B型免疫計(jì)數(shù)器測定放射強(qiáng)度，記錄數(shù)值結(jié)果。

1.5.2腦組織HSP70表達(dá)免疫組化SABC法檢測大鼠腦組織HSP70的表達(dá)，陽性細(xì)胞為細(xì)胞核著棕黃色，陰性為細(xì)胞核著藍(lán)色。通過安裝在OlympusBX60顯微鏡上的SPO-Ⅱ數(shù)碼成相軟件系統(tǒng)以及Metamorph圖像分析軟件對(duì)HSP70免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行拍照分析。以統(tǒng)一的灰度值閾值作為度量標(biāo)準(zhǔn)界定陽性染色部位，采用陽性面積作為測量指標(biāo)，每只大鼠選5張切片，在20×10，40×10的倍數(shù)下，于腦梗死中心區(qū)，梗死周邊區(qū)，對(duì)側(cè)正常區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照、測量，測定陽性信號(hào)平均光密度值，讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　地黃飲子加減方對(duì)MCAO模型大鼠血漿HPA軸的干預(yù)作用

正常組、地黃飲子組、模型組的ACTH、CRH、COR各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)提示均符合正態(tài)分布，各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA方差分析提示總體有差異，以LSD法進(jìn)行多組間比較，結(jié)果顯示，在腦缺血發(fā)生后7天，模型組的ACTH、CRH含量均明顯低于正常組，COR含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；地黃飲子組的COR明顯低于正常組、模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；地黃飲子組ACTH、CRH含量均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ACTH、CRH含量略低于正常組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1　各組大鼠灌胃7天后血漿HPA軸含量變化

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01

2.2　地黃飲子對(duì)MCAO模型大鼠腦組織HSP70表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)

HSP70陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)在梗塞周邊區(qū)的皮層,主要為神經(jīng)細(xì)胞,也可見少量的膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。陽性表達(dá)主要在胞質(zhì),DAB顯色呈棕黃色者即為陽性細(xì)胞。模型組僅有少量表達(dá)，與模型組比較，地黃飲子組表達(dá)顯著增加，見圖1、圖2。

圖1　模型組大鼠腦組織HSP70表達(dá) (免疫組化SABC法染色，×400)

圖2　地黃飲子組大鼠腦組織HSP70表達(dá) (免疫組化SABC法染色，×400)

正常組、地黃飲子組、模型組腦組織HSP70表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)提示均符合正態(tài)分布，各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA方差分析提示總體有差異，以LSD法進(jìn)行多組間比較，結(jié)果顯示，正常組為陰性，模型組、地黃飲子組腦組織與正常組比較均可見HSP70表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同模型組相比，地黃飲子組腦組織的HSP70表達(dá)更為明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)提示地黃飲子加減方可提高SD大鼠腦組織HSP70的表達(dá)，在腦缺血急性期發(fā)揮腦保護(hù)作用，見表2。

表2　地黃飲子對(duì)MCAO模型大鼠腦組織 HSP70表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

2.3　MCAO大鼠缺血后HPA軸與腦組織HSP70表達(dá)的相關(guān)性分析

模型組COR含量與腦組織HSP70表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，但CRH、ACTH則與HSP70表達(dá)無明顯相關(guān)性，見表3。地黃飲子組HPA軸各指標(biāo)與腦組織HSP70表達(dá)無明顯相關(guān)性，見表4。

表3　模型組ACTH、CRH、COR含量與HSP70 表達(dá)的相關(guān)性分析

注：aP<0.01，兩個(gè)指標(biāo)顯著相關(guān)

表4　地黃飲子組ACTH、CRH、COR含量與HSP70 表達(dá)的相關(guān)性分析

3　討論

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，地黃飲子灌胃能夠改善腦缺血大鼠血漿HPA軸的紊亂狀態(tài)，通過提高CRH含量抑制大鼠體內(nèi)COR的釋放。這一結(jié)果支持了鐘歷勇、沈自尹等[2-3]提出的補(bǔ)腎藥可通過上調(diào)下丘腦CRF_mRNA表達(dá)來保護(hù)HPA軸免受外源性皮質(zhì)醇的抑制，補(bǔ)腎藥對(duì)腎陽虛證的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)定位于下丘腦的觀點(diǎn)。

熱休克蛋白70(HSP70)是一種極敏感和可靠的腦缺血的標(biāo)志，它是HSP家族中的一種，主要功能是保護(hù)各種應(yīng)激所致的細(xì)胞損傷。HSP70對(duì)大腦缺血性損傷有保護(hù)作用，已有的研究結(jié)果證實(shí)，它的保護(hù)作用機(jī)制為：作為分子伴侶，有助于蛋白質(zhì)的正確折疊；通過直接抑制促細(xì)胞凋亡蛋白的功能及間接提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平而抑制細(xì)胞凋亡等[4]。另有研究證明，地黃飲子孵育骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠促進(jìn)大鼠腦梗塞HSP70和神經(jīng)生長因子VEGF的表達(dá)，通過此作用途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明地黃飲子加減方能夠通過促進(jìn)MCAO大鼠梗死區(qū)大腦皮層的HSP70表達(dá)，在腦缺血后發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。

有研究者認(rèn)為梗死后的高糖皮質(zhì)激素水平是加重病情的一個(gè)原因，另有研究發(fā)現(xiàn)，MCAO模型大鼠腦組織內(nèi)HSP70主要位于缺血的半暗帶區(qū)[6]。HSP70是機(jī)體在遭受應(yīng)激刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，正常腦內(nèi)不存在，但可被腦缺血、缺氧等各種損傷迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生。模型組血漿COR含量平增高的情況下可加速誘導(dǎo)缺血區(qū)HSP70的表達(dá)。本研究結(jié)果說明，MCAO大鼠經(jīng)地黃飲子灌胃后，改善了HPA軸的紊亂狀態(tài)，降低了血漿內(nèi)COR的含量，提高了腦組織HSP70的表達(dá)，通過多途徑作用于機(jī)體發(fā)揮著缺血急性期的腦保護(hù)作用。

[1]苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].第一版.北京:中國中醫(yī)藥出版社,1997:142.

[2]鐘歷勇，沈自尹，鄭仲承，等.下丘腦-垂體-腎上腺軸大鼠下丘腦CRHmRNA表達(dá)[J].上海鐵道大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19(增刊)：8.

[3]鐘歷勇，沈自尹，蔡定芳，等. 補(bǔ)脾健身活血三類復(fù)方對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸及CRF基因表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17(1)：39.

[4]Giffard RG, Yenari MA. Manymechanisms for hsp70 protection from cerebral ischemia[J].J Neurosurg Anesthesio,2004, 16(1)：53.

[5]程小麗，張煦，劉永琦，等.地黃飲子孵育BMSCs移植對(duì)大鼠腦梗塞HSP70和VEGF表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010,21(11)：2858-2859.

[6]牛敬忠，王賢軍，夏青，等.大鼠局灶性腦梗死后細(xì)胞凋亡及熱休克蛋白70表達(dá)的變化[J].中國微循環(huán)，2005,9(3)：179-181.