大鼠全腦照射后海馬區(qū)VEGF表達(dá)變化及超微結(jié)構(gòu)改變

楊偉芳 丁維軍 孫曉南 朱敏 楊海華

●論 著

大鼠全腦照射后海馬區(qū)VEGF表達(dá)變化及超微結(jié)構(gòu)改變

楊偉芳 丁維軍 孫曉南 朱敏 楊海華

目的 探討單次大劑量全腦照射后大鼠海馬區(qū)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的變化及其超微結(jié)構(gòu)改變。 方法 以雌性SD大鼠作為研究對(duì)象，使用RT-PCR檢測(cè)全腦照射后大鼠海馬區(qū)VEGF mRNA的表達(dá)變化，電鏡觀察照射后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體及血管內(nèi)皮等超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果 全腦照射后1d大鼠海馬區(qū)VEGF mRNA表達(dá)出現(xiàn)短暫下降，放療后1、2、4和8周時(shí)VEGF mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0．05）。20Gy放療后4周，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體水腫，空泡形成；毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙增加，管腔狹窄。結(jié)論 VEGF參與大鼠腦部放療后損傷應(yīng)答反應(yīng)，這可能為將來的腦損傷防護(hù)提供新的靶點(diǎn)。

血管內(nèi)皮生長因子 海馬 腦損傷 放射療法 大鼠 電子顯微鏡

隨著腫瘤治療的快速發(fā)展，患者生存期延長，放射治療后腦損傷等問題日益突出，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。放射性腦損傷與腦水腫、血腦屏障破壞等密切相關(guān)。海馬是認(rèn)知、學(xué)習(xí)的關(guān)鍵部位，在認(rèn)知發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可通過調(diào)節(jié)海馬區(qū)血管、神經(jīng)形成從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力[1]，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過觀察放療后大鼠海馬區(qū)VEGF mRNA的表達(dá)變化，并利用電子顯微鏡觀察該區(qū)神經(jīng)元線粒體及血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化，以探討海馬區(qū)在放射性腦損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙發(fā)病過程中的病理改變及部分分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級(jí)健康雌性SD大鼠共36只，6～8周齡，體重（200±10）g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院公共科研平臺(tái)動(dòng)物房IVC獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)。TRIzol購于美國Invitrogen公司，隨機(jī)引物、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等購自上海吉瑞公司。

1.2 動(dòng)物分組與全腦照射 按簡(jiǎn)單隨機(jī)法將大鼠分為全腦照射后1d、1、2、4和8周及對(duì)照6個(gè)組別，每組各6只。單次全腦照射方法：大鼠經(jīng)3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后，俯臥于西門子加速器床板（西門子KD2型），應(yīng)用加速器產(chǎn)生的6mV-X線（劑量率200～210cGy/min），源皮距100cm。照射野3cm× 2cm，上界位于雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，左右露空。用1cm厚的組織補(bǔ)償物覆蓋照射野，鉛塊屏蔽雙眼、頸部及胸腹部。參考深度為1.5cm，照射總劑量20Gy[2]。

1.3 標(biāo)本制作及海馬區(qū)VEGF mRNA檢測(cè) 全腦照射后1d、1、2、4和8周，各組大鼠經(jīng)3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后開胸，0.9%氯化鈉溶液250ml灌洗后，完整取腦，分離海馬區(qū)腦組織，液氮速凍研磨成粉后，TRIzol抽提總RNA。引物序列：VEGF上游引物5′-CAC TGG ACC CTGGCT TTA CT-3′，下游引物5′-TGC TGGCTT TGGTGA GGT T-3′，擴(kuò)增片段長458 bp。RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)：在提取的總RNA中加入隨機(jī)引物及M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA鏈。取cDNA 0.1μg，加入10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl21μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，20pmol/μl的上下游引物各0.5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25μl。于Thermo PX2型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參照。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；94℃變性45s，61℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.7%瓊脂糖凝膠電泳，于BIO-RAD Gel 2000凝膠成像儀上成像，Quantity One軟件作半定量分析，記錄每條目的條帶灰度值與內(nèi)參的比值。

1.4 電鏡觀察 大鼠全腦照射后4周，3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后開胸，0.9%氯化鈉溶液250ml灌洗后，完整取腦，切取1mm×2mm的海馬區(qū)腦組織條，以2.5%戊二醛前固定，l%鋨酸后固定，乙醇丙酮系列梯度脫水后Epon 812包埋，超薄切片機(jī)切片，鈾鉛染色，H-600A-2透射電鏡下觀察并攝片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)VEGF mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組比較，全腦照射后1d大鼠海馬區(qū)VEGF mRNA表達(dá)出現(xiàn)短暫下降（0.782±0.065 vs 0.570±0.044，P＜0.01），而放療后1、2、4和8周時(shí)VEGF mRNA表達(dá)水平分別為0.797±0.055、0.657±0.065、0.844±0.058 和 0.669± 0.061，與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見圖1。

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 全腦照射后4周，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體水腫，空泡形成；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，血管周圍間隙擴(kuò)大，血管管壁增厚，管腔狹窄，見圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)VEGF mRNA的表達(dá)（1：對(duì)照組；2～6分別為照射后1d、1、2、4和8周）

圖2 全腦照射后4周大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化（A：線粒體水腫，空泡形成（箭頭所示），×20 000；B：血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，管腔狹窄，×40 000）

3 討論

對(duì)位于腦、脊髓及其鄰近部位腫瘤的患者來說，放射性腦損傷是主要的放療不良反應(yīng)[3]。放射性腦損傷根據(jù)出現(xiàn)時(shí)間分為急性期損傷和遲發(fā)性反應(yīng)。急性期損傷多發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)單次大劑量照射后24h以內(nèi)，血腦屏障破壞和腦水腫是主要病理基礎(chǔ)。遲發(fā)性反應(yīng)形態(tài)學(xué)改變包括毛細(xì)血管擴(kuò)張、膨脹、血管壁透明化、血管壁增厚和纖維壞死等。全腦照射后的認(rèn)知障礙與海馬區(qū)神經(jīng)再生功能受損有關(guān)[4]。

VEGF也被稱為血管滲透因子，它是血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是強(qiáng)有力的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可促進(jìn)細(xì)胞生長和血管形成，與腦損傷、血腦屏障功能破壞等相關(guān)。研究報(bào)道其具有神經(jīng)保護(hù)活性，可調(diào)節(jié)新生血管，影響海馬區(qū)神經(jīng)形成從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力[1]。腦損傷時(shí)內(nèi)源性VEGF信號(hào)途徑是細(xì)胞生存所必需的，VEGF抑制可減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞死亡。內(nèi)源性VEGF在促進(jìn)腦損傷后星形細(xì)胞的存活和增殖中起重要作用[5]。大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中，海馬區(qū)VEGF表達(dá)水平在腦外傷后12h出現(xiàn)升高，7d時(shí)達(dá)峰值。隨著VEGF表達(dá)水平的升高，海馬區(qū)神經(jīng)元形成亦增加，而VEGF抑制則減少了海馬區(qū)神經(jīng)元形成[6]。大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h海馬區(qū)VEGF表達(dá)升高伴有凋亡發(fā)生[7]。而肺炎球菌腦膜炎模型中，VEGF水平明顯下降[8]。因此，不同的損傷類型中VEGF表達(dá)變化可能存在差異。電離輻射既可激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡致早期血腦屏障破壞，引起急性期放射性腦損傷，也可通過誘導(dǎo)基因表達(dá)改變、促使乏氧微環(huán)境形成等導(dǎo)致遲發(fā)性反應(yīng)。乏氧可誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生，而VEGF可使血管滲透性增高，從而形成惡性循環(huán)。VEGF還可通過影響細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）和緊密連接蛋白的表達(dá)從而破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血腦屏障破壞，引起遲發(fā)性反應(yīng)[1]。

本研究中，海馬區(qū)VEGF mRNA表達(dá)在放射后早期存在短暫下降，證實(shí)其參與海馬區(qū)急性期放射性腦損傷應(yīng)答。電鏡顯示全腦照射后4周時(shí)海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體水腫、空泡形成，合并海馬區(qū)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、管腔狹窄等遲發(fā)性反應(yīng)病理改變，但海馬區(qū)VEGF mRNA表達(dá)在放射后4、8周時(shí)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，海馬區(qū)VEGF mRNA水平是否與放射性遲發(fā)性反應(yīng)相關(guān)尚需進(jìn)一步研究明確，其對(duì)海馬區(qū)ICAM-1表達(dá)的影響將在后續(xù)研究中進(jìn)一步報(bào)道。

Nordal等[9]研究報(bào)道，與野生型和VEGF高表達(dá)的小鼠相比，VEGF低表達(dá)的小鼠在放射后更具有神經(jīng)保護(hù)作用，且其出現(xiàn)虛弱、癱瘓的時(shí)間間隔相對(duì)延長。早期抑制VEGF可以通過降低血管滲透性從而減少放射性壞死的發(fā)生[10]。本研究中放射后1d內(nèi)海馬區(qū)的VEGF mRNA表達(dá)水平短暫下降是否是體內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制尚不明確。與上述報(bào)道相反，亦有研究顯示VEGF可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。研究報(bào)道低劑量放療后海馬顆粒層細(xì)胞VEGF表達(dá)下降，并對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元形成產(chǎn)生長時(shí)間的抑制作用，與長時(shí)間的行為缺陷相關(guān)。Wong-Goodrich等[11]研究亦顯示，全腦照射后每日跑步可以通過上調(diào)海馬區(qū)腦源性VEGF表達(dá)減輕放療后空間記憶功能的下降。本研究中全腦照射后早期海馬區(qū)VEGF mRNA表達(dá)水平短暫下降是否與腦功能缺陷相關(guān)尚需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，本研究表明大劑量全腦照射后急性期內(nèi)，海馬區(qū)VEGF mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)短暫下降，而照射后1、2、4和8周時(shí)VEGF mRNA表達(dá)水平恢復(fù)正常。說明VEGF參與大鼠全腦照射后海馬區(qū)的急性期放射損傷應(yīng)答，它可能是體內(nèi)的損傷后自我保護(hù)機(jī)制，亦可能影響海馬區(qū)的神經(jīng)元形成，具體作用尚需進(jìn)一步研究明確。照射后4周海馬區(qū)存在神經(jīng)元線粒體水腫、血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大等形態(tài)學(xué)改變，可能是放射治療后認(rèn)知功能障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)。VEGF的早期變化是否與晚期損傷直接相關(guān)尚需進(jìn)一步研究明確，通過不同時(shí)相對(duì)VEGF的干預(yù)能否影響海馬區(qū)的神經(jīng)形成及功能將為放射性腦損傷的防護(hù)提供新的依據(jù)。

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Changes of VEGF expression and ultrastructure in hippocampus of adult rats after whole-brain irradiation

Objective To investigate the changes of VEGF expression and ultrastructure in hippocampus of adult rats after whole-brain irradiation．Methods The whole brain of female Sprague-Dawley rats was irradiated by 20Gy 6mV X-ray．The expression of VEGF mRNA in hippocampus tissue before and 1d,1,2,4,8w after ionizing radiation was detected by RT-PCR．The ultra-structural changes of hippocampus were observed by electronic microscope．Results RT-PCR showed a transient decrease in VEGF mRNA expression within 1d after exposure to a single dose of 20Gy 6mV X-ray ionizing radiation;however,there were no differences in VEGF mRNA expression at 1,2,4,8w after ionizing radiation when compared to controls(P＞0．05)．Neuronal mitochondria edema，vacuolization,endothelial gap increase and lumen narrow were demonstrated by electron microscope at 4w after whole brain irradiation．Conclusion VEGF may be involved in early radiation-induced damage in the hippocampus, which indicates that VEGF might be a novel target for prevention of radiation-induced brain injury．

VEGF Hippocampus Brain injury Radiation RatElectron microscopy

2012-12-17）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2110739）

317000 臺(tái)州，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院放療科（楊偉芳、丁維軍、楊海華），公共科研平臺(tái)（朱敏）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院放療科（孫曉南）

丁維軍，E-mail:dingwj@enzemed.com