徐伶 楊宗興 陳峰 虞容 楊勁 孟忠華

人信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子shRNA載體的構(gòu)建與鑒定

徐伶 楊宗興 陳峰 虞容 楊勁 孟忠華

目的 構(gòu)建針對(duì)人信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）基因的shRNA表達(dá)載體，檢測(cè)其對(duì)STAT1基因的沉默效果。 方法 設(shè)計(jì)針對(duì)STAT1的shRNA序列，克隆到pGPU6質(zhì)粒載體，并進(jìn)行測(cè)序、轉(zhuǎn)染和鑒定。 結(jié)果 DNA測(cè)序顯示成功構(gòu)建了4個(gè)shRNA表達(dá)載體。shRNA能有效抑制STAT1基因在人宮頸癌細(xì)胞株TZM-bl細(xì)胞中的表達(dá)，抑制率為63%。 結(jié)論 成功構(gòu)建了針對(duì)人STAT1基因的shRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA STAT1。

RNA干擾 人信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1 小發(fā)夾狀RNA

自發(fā)現(xiàn)RNA干擾（RNA interference，RNAi）現(xiàn)象以來(lái)，利用模擬內(nèi)源生發(fā)途徑的小發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNAs，shRNAs）沉默靶基因的表達(dá)已成為研究基因功能的一項(xiàng)基準(zhǔn)技術(shù)。與傳統(tǒng)的小干擾RNA（siRNA）相比，shRNA的優(yōu)勢(shì)在于能夠穩(wěn)定整合有利于長(zhǎng)期表達(dá)，包裝病毒可轉(zhuǎn)染難以轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞或組織，并可設(shè)置誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等[1]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription-1, STAT1）是病毒感染中干擾素反應(yīng)的關(guān)鍵中介子之一。本研究擬初步建立STAT1-shRNA克隆，以期為觀察STAT1的生物學(xué)功能提供工具。

1 材料和方法

1.1 材料 核酸抽提試劑盒、Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。XhoⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。去內(nèi)毒素質(zhì)粒 DMEM培養(yǎng)基、Trizol、Lipofectamine2000、Fugene轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen或Roche公司。pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪公司。表達(dá)CD4、CXCR4、CCR5的人宮頸癌細(xì)胞株TZM-bl細(xì)胞購(gòu)于中科院上海巴斯德研究所。DH5α菌種為本室保存。STAT1和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA靶序列的設(shè)計(jì) 根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則及STAT1（Gene bank：NM_007315）cDNA序列，使用DNA oligo等工具輔助定位潛在靶向序列，設(shè)計(jì)針對(duì)STAT1基因編碼區(qū)序列中的3段序列（645-665、2376-2396、2617-2637）的干擾靶序列，同時(shí)建立陰性對(duì)照（NC）。所有序列經(jīng)使用BLAST和相應(yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除同源性后提交Invitrogen公司合成。STAT1-sh1序列上游：5′-TCGAGCAAGCGTAATCTTCAGGATATTCAAGAGATATCCTGAAGATTACGCTTGCTT-TTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAAGCAAGCGTAATCTTCAGGATATCTCTTGAATATCCTGAAGATTACGCTTGC-3′；STAT1-sh2序列上游：5′-TCGAGCCCTGAAGTATCTGTATCCAATTCAAGAGATTGGATACAGATACTTCAGG GTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAACCCTGAAGTATCTGTATCCAATCTCTTGAATTGGATACAGATACTTC AGGGC-3′；STAT1-sh3序列上游：5′-TCGAGCGACAGTATGATGAACACAGTTTCAAGAGAACTGTGTTCATCATACTGTCGTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAACGACAGTATGATGAACACAGTTCTCTTGAAACTGTGTTCATCATACTGTCGC-3′；陰性對(duì)照 STAT1-NC序列上游：5′-TCGAGCTCCCGTGAATTGGAATCCTTTCAAGAGAAGGATTCCAATTCACGGGAGCTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAAAAAGCTCCCGTGAATTGGAATCCTTCTCTTGAAAGGATTCCAATTCACGGGAGC-3′。其中序列TCGA及GATC分別是XhoⅠ、BamHⅠ酶切后粘端；shRNA模板loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。

1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA STAT1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 化學(xué)合成shRNA的正義鏈和反義鏈100μM，分別取5μl正、反義寡核苷酸，2μl 10×退火緩沖液（30mM Hepes，pH 7.4，100 mM醋酸鉀，2mM醋酸鎂）及8μl水。煮沸4min，室溫放置15min后置于4℃10～15min。將退火處理后的shRNA模板稀釋2 500倍，終濃度為 10nM/L用于連接反應(yīng)。將退火后的雙鏈shRNA模板和pGPU6/GFP/Neo載體于22℃連接過(guò)夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，在卡那霉素抗性平板上篩選重組質(zhì)粒載體。各平板隨機(jī)取2克隆搖菌后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.3 STAT1 shRNA質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取測(cè)序正確的各組質(zhì)粒。以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)TZM-bl細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，將細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板。隨機(jī)將其分為實(shí)驗(yàn)組1～3（分別轉(zhuǎn)染pSTAT1-sh1～3），空白對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞組）及陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pSTAT1-NC）。每孔加入4μg質(zhì)粒，10μl脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%胎牛血清的無(wú)抗生素培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24～48h倒置熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)STAT1蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，上樣檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后用quantity one圖像分析軟件分析各組蛋白條帶的光密度值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 采用HPLC純化的合成寡核苷酸經(jīng)退火后直接連接經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ酶切的質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的各平板克隆中均含有正確重組的質(zhì)粒載體。重組質(zhì)粒分別命名為pSTAT1-sh1、pSTAT1-sh2、pSTAT1-sh3和pSTAT1-NC，見(jiàn)圖1。

2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光蛋白表達(dá)的觀察 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下以波長(zhǎng)488nm的藍(lán)光激發(fā)，在同一視野下觀察。轉(zhuǎn)染后24h，實(shí)驗(yàn)組1～3及陰性對(duì)照組細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光，均勻分布于整個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率均＞80%，各組間無(wú)明顯不同，空白對(duì)照組細(xì)胞無(wú)熒光表達(dá)，見(jiàn)插頁(yè)圖2。

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果及熒光蛋白表達(dá)（A-D：未激發(fā)時(shí)各組TZM-bl細(xì)胞，B×60，其余×20；E-F：轉(zhuǎn)染pSTAT1-sh2的TZM-bl細(xì)胞，E×20，F(xiàn)×60；G：轉(zhuǎn)染STAT1-NC的TZM-bl細(xì)胞，×20；H：空白對(duì)照組）

2.3 重組質(zhì)粒對(duì)STAT1蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果提示重組質(zhì)粒pSTAT1-sh3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的STAT1蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），而重組質(zhì)粒pSTAT1-sh1和pSTAT1-sh2轉(zhuǎn)染組的STAT1蛋白表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組，抑制率63%（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖1 重組質(zhì)粒的DNA測(cè)序鑒定

3 討論

STAT1是STAT家族中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，編碼基因位于小鼠1號(hào)染色體上，相當(dāng)于人2號(hào)染色體的q19至q33區(qū)，編碼約750～795個(gè)氨基酸長(zhǎng)度序列的蛋白質(zhì)。STAT1最初是作為病毒感染中干擾素反應(yīng)的胞質(zhì)內(nèi)介導(dǎo)子而被識(shí)別[2]。STAT1基因缺陷鼠受不同類(lèi)型病原體攻擊時(shí)會(huì)快速死亡；多種病毒包括水皰性口炎病毒（VSV）與鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）感染后，STAT1的表達(dá)起保護(hù)作用。相反，一些病原體如EB病毒已進(jìn)化出利用STAT1活化而促進(jìn)病原體復(fù)制的生存策略[3]。STAT1的生物學(xué)功能主要包括：（1）激活免疫系統(tǒng)：研究顯示STAT1參與經(jīng)MHCⅠ/Ⅱ加工與遞呈抗原肽的全過(guò)程，包括表達(dá)多功能蛋白酶2（LMP2）、多功能蛋白酶7（LMP7）、抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體1（TAP1），并通過(guò)MHCⅡ類(lèi)分子反式激活因子（CIITA）間接激活MHC-Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)。STAT1經(jīng)誘導(dǎo)T-bet因子上調(diào)繼而推動(dòng)免疫球蛋白的類(lèi)型轉(zhuǎn)換。（2）抑制細(xì)胞生長(zhǎng)：STAT1誘導(dǎo)周期蛋白依賴激酶（CDK）抑制子p21waf1/ CIP1、p27kip1的表達(dá)影響細(xì)胞增殖。同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡蛋白酶前體與Fas（CD95/APO-1）、p53等介入凋亡通路。

圖2 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)STAT1蛋白表達(dá)水平的影響

在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上，STAT1的上游刺激分子眾多，包括干擾素類(lèi)[4]、白介素類(lèi)[5-8]、生長(zhǎng)因子[5]、多種激素等，其活化的主要生化形式是第701位酪氨酸磷酸化，也包括乙?；凹谆问絒9]。STAT1自身作為轉(zhuǎn)錄因子之一，其下游靶基因眾多。未激活狀態(tài)下，STAT1可誘導(dǎo)免疫調(diào)控基因的組成性表達(dá)，如LMP2、TAP1、凋亡蛋白酶前體3等基因。STAT1的激活伴隨趨化因子9（CXCL9）、周期蛋白依賴激酶抑制因子p21等分子上調(diào)。STAT1可與NF-κB協(xié)同誘導(dǎo)趨化因子10（IP10）和細(xì)胞間黏附因子1（ICAM1），協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子Sp1誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）等的表達(dá)。

筆者的前期篩查發(fā)現(xiàn)，STAT1上調(diào)是HIV-1急性或慢性感染患者中的高頻事件，尚不清楚STAT1的持續(xù)性表達(dá)增高與HIV-1慢性免疫活化之間的關(guān)系。為進(jìn)一步研究STAT1在HIV-1持續(xù)性感染中的分子機(jī)制，本研究構(gòu)建了針對(duì)STAT1基因的 pGPU6/GFP/ Neo-shRNA表達(dá)載體。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）根據(jù)已知siRNA規(guī)則設(shè)計(jì)的shRNA片段，可直接連接酶切載體，無(wú)需修飾或過(guò)多酶切等步驟，降低分子重組中的不確定性。（2）初次克隆正確率＞60%，無(wú)需PCR或酶切篩選，可減少構(gòu)建耗時(shí)及成本。（3）載體中含有GFP基因，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白，通過(guò)熒光顯微鏡可確定重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。本研究中Western blot結(jié)果提示，重組質(zhì)?？捎行Ц蓴_STAT1基因在TZM-bl細(xì)胞中的表達(dá)，可為進(jìn)一步研究STAT1基因在HIV-1感染中的作用提供研究手段。

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Construction and validation of shRNA vectors targeting human STAT1

Objective To construct pGPU6 shRNA expression vector targeting human STAT1 gene and to evaluate its silencing effect in TZM-bl cell line．Methods The targeting sequences were designed and synthesized,and cloned into the pGPU6/GFP/Neo vector．After confirmation by DNA sequencing,the recombinant vectors were transfected into TZM-bl cells,and the expression levels of STAT1 were determined． Results Four shRNA clones were successfully constructed and confirmed by DNA sequencing．The transfected cells presented gene silencing effect and the protein expression of STAT1 was down-regulated by 63%．Conclusion We have successfully constructed STAT1-shRNA expression vector and its effect is validated in transfected TZM-bl cells．

RNA interference STAT1 ShRNA

2013-03-11）

（本文編輯：胥昀）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2012KYA060）

310006杭州，浙江省血液中心質(zhì)量法規(guī)部（徐伶、虞容、楊勁、孟忠華），血庫(kù)（陳峰）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（楊宗興）

孟忠華，E-mail:ywk@zjb.org.cn