朱艷雙 趙德安

水楊酸鈉注射后大鼠聽(tīng)覺(jué)通路突觸素表達(dá)的變化

朱艷雙 趙德安

目的 檢測(cè)水楊酸鈉注射后大鼠耳蝸核、上橄欖核、下丘腦及聽(tīng)皮層突觸素表達(dá)的變化，探討聽(tīng)覺(jué)通路的可塑性變化與耳鳴發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。 方法 將36只大鼠隨機(jī)分為6組（每組6只）：按照注射藥物時(shí)間長(zhǎng)短的不同分為Ⅰ、Ⅱ組，其中Ⅰ組注射藥物時(shí)間為14d，Ⅱ組注射藥物時(shí)間為21d（空白對(duì)照組不注射藥物）；兩組又各自分為A、B、C 3個(gè)亞組，其中A組為水楊酸鈉組，B為0．9%氯化鈉溶液組，C為空白對(duì)照組。ⅠA組：每次條件反射訓(xùn)練前3h腹腔注射10%水楊酸鈉溶液（350mg/kg），至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；ⅠB組：每次條件反射訓(xùn)練前3h腹腔注射同體積0．9%氯化鈉溶液，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；ⅠC組：飼養(yǎng)在安靜環(huán)境中，不限飲食，不注射藥物，不進(jìn)行條件反射訓(xùn)練；ⅡA、ⅡB、ⅡC組的分組方法同前。應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組大鼠聽(tīng)覺(jué)通路中4個(gè)核團(tuán)突觸素表達(dá)的情況。 結(jié)果 早期耳鳴組（ⅠA）與持續(xù)耳鳴組（ⅡA）同其余組大鼠相比，耳蝸核、上橄欖核、下丘腦、聽(tīng)皮層突觸素的表達(dá)都明顯增多（均P＜0．01）；且ⅡA組各核團(tuán)中突觸素的表達(dá)均較ⅠA組增多（均P＜0．01）。結(jié)論 水楊酸鈉注射可成功建立大鼠耳鳴模型，耳鳴大鼠聽(tīng)覺(jué)通路突觸素表達(dá)的改變?yōu)槎Q的中樞源性學(xué)說(shuō)提供了部分理論依據(jù)。

水楊酸鈉 耳鳴 神經(jīng)可塑性 突觸素 聽(tīng)覺(jué)核團(tuán)

既往學(xué)者多認(rèn)為耳鳴產(chǎn)生于外周聽(tīng)覺(jué)感受器，但是近年來(lái)越來(lái)越多的研究證明耳鳴是在聽(tīng)覺(jué)中樞部位產(chǎn)生[1]。因水楊酸可引起可逆性的耳鳴及聽(tīng)力損失，故現(xiàn)已成為常用誘發(fā)藥物廣泛應(yīng)用于與耳鳴相關(guān)的基礎(chǔ)研究中。研究表明，水楊酸鈉能引起動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)通路上神經(jīng)元電活動(dòng)及各種神經(jīng)遞質(zhì)和受體的一系列改變，故推測(cè)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)發(fā)生功能重組或可塑性變化，是耳鳴產(chǎn)生與維持的主要原因。突觸素（synaptophysin,SYN）是一種與突觸功能密切相關(guān)的膜蛋白,相對(duì)分子量為38 kd，英文縮寫(xiě)可為p38、SYP或SYN，1985年由Jahn等[2]年首先從大鼠腦突觸囊泡中提取。它廣泛存在于機(jī)體所有神經(jīng)末梢，特異性地分布于突觸前膜囊泡上，與神經(jīng)生長(zhǎng)、修復(fù)、再生和突觸重建密切相關(guān)。在突觸重建時(shí)，SYN的表達(dá)明顯增多，因此SYN和神經(jīng)可塑性密切相關(guān)，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性的指標(biāo)。

本研究通過(guò)注射水楊酸鈉建立大鼠耳鳴模型，檢測(cè)大鼠聽(tīng)覺(jué)通路中4個(gè)核團(tuán)SYN表達(dá)的變化，分析水楊酸鈉對(duì)聽(tīng)覺(jué)通路神經(jīng)元可塑性變化的影響，并探討耳鳴產(chǎn)生的中樞源性機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用2～3月齡、健康、耳廓反應(yīng)靈敏、無(wú)中耳感染、無(wú)強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，體重200～250g的雄性Wistar大鼠36只，由上海斯萊特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑 水楊酸鈉購(gòu)于AMRESCO公司，小鼠抗大鼠SYN抗體（一抗）購(gòu)于武漢博士德公司，即用型SP染色試劑盒（內(nèi)含5%BSA封閉液、二抗及SABC）購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)公司，10%水合氯醛溶液及40g/L多聚甲醛溶液均來(lái)自廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室。

1.3 耳鳴動(dòng)物模型建立與分組 參照賈明輝等[3]的方法，建立耳鳴動(dòng)物行為學(xué)模型。將干渴的大鼠置于有背景白噪聲的隔聲室內(nèi)反復(fù)進(jìn)行條件反射訓(xùn)練，在關(guān)閉背景噪聲后即于大鼠嘴部給予電刺激，使動(dòng)物將耳內(nèi)聲音的有無(wú)與安全與否聯(lián)系起來(lái)，形成“背景噪聲停止-舔水減少或停止”的條件反射。于廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院隔聲室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照紙袋抽簽法將大鼠隨機(jī)分為6組。ⅠA組：早期耳鳴組，在條件反射建立前每次訓(xùn)練前3h腹腔注射10%水楊酸鈉溶液（350mg/kg）直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；ⅠB組：早期0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組，在條件反射建立前每次訓(xùn)練前3h腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;ⅠC組：早期空白對(duì)照組，大鼠飼養(yǎng)在安靜的環(huán)境中，不限飲食、不注射藥物，不進(jìn)行條件反射訓(xùn)練，直至與ⅠA組、ⅠB組一同斷頭取標(biāo)本。ⅠA組和ⅠB組動(dòng)物共注射藥物14d。ⅡA組：持續(xù)耳鳴組，在條件反射建立前每次訓(xùn)練前3h腹腔注射10%水楊酸鈉溶液（350mg/kg），直到耳鳴模型建立成功后，每天同一時(shí)間腹腔繼續(xù)注射同體積水楊酸鈉7d；ⅡB組：持續(xù)0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組，在條件反射建立前每次訓(xùn)練前3h腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液，直到條件反射消退后，繼續(xù)每天同一時(shí)間繼續(xù)腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液7d；ⅡC組：持續(xù)空白對(duì)照組。飼養(yǎng)在安靜環(huán)境中，不限飲食、不注射藥物，不進(jìn)行條件反射訓(xùn)練，直至與ⅡA、ⅡB組一同斷頭取標(biāo)本。ⅡA組和ⅡB組動(dòng)物共注射藥物21d。

1.4 取材及免疫組織化學(xué)染色

1.4.1 心臟灌注及組織切片 最后1次注射藥物后3h，予10%水合氯醛（0.4ml/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，自左心室向外主動(dòng)脈插管，快速注入0.9%氯化鈉溶液200ml沖出血液后切開(kāi)右心房，再以40g/L多聚甲醛液400ml灌注固定，待大鼠出現(xiàn)四肢抖動(dòng)、強(qiáng)直、頭向后仰似角弓反張時(shí)迅速斷頭取腦。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[4]分別切取含聽(tīng)皮層、下丘、上橄欖核、耳蝸核的腦組織，多聚甲醛固定過(guò)夜，經(jīng)脫水、透明、浸蠟包埋后，連續(xù)4μm冠狀位切片，用于免疫組化染色。

1.4.2 SYN免疫組化檢測(cè) 切片常規(guī)脫蠟至水化，檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)后加入3%過(guò)氧化氫滅活10min，PBS洗滌3min×3次后滴加5%BSA，室溫放置20min后，滴加一抗室溫下濕盒內(nèi)孵育1h，PBS洗滌3次后滴加二抗，室溫下濕盒內(nèi)孵育20min，PBS洗滌3次后滴加SABC，室溫下孵育20min，PBS洗滌3次后加入100μl新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3～10min；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。SYN表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元軸突終末為棕黃色，在光鏡下呈點(diǎn)狀或顆粒狀分布。

1.4.3 圖像采集分析 以圖像分析系統(tǒng)測(cè)定特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值（average optical density, AOD）來(lái)反映突觸數(shù)量的變化[5]。Olympus顯微攝像系統(tǒng)在同一光強(qiáng)度、同一放大倍數(shù)下采集圖片。每個(gè)標(biāo)本取2張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非重疊視野，采用IPP6.0軟件進(jìn)行分析，最后取5個(gè)數(shù)值的平均值為每張切片的AOD。計(jì)算每組大鼠各個(gè)聽(tīng)覺(jué)通路核團(tuán)：聽(tīng)皮層、下丘腦、上橄欖核和耳蝸核的AOD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，再用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果 ⅠA、ⅡA組大鼠條件反射消退時(shí)間分別為（5.67±0.82）、（6.00±0.63）d；ⅠB、ⅡB組分別為（4.00±0.89）、（4.17±0.75）d，ⅠA、ⅡA組與ⅠB、ⅡB組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01），說(shuō)明ⅠA和ⅡA組大鼠耳鳴模型造模成功。

2.2 免疫組化檢測(cè) 結(jié)果提示SYN在各組大鼠各個(gè)核團(tuán)中均有表達(dá)，各組AOD見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，ⅠA組、ⅡA組同對(duì)照組（B、C組）大鼠相比，耳蝸核、上橄欖核、聽(tīng)皮層、下丘腦SYN的表達(dá)均明顯增多（均P＜0.01）；且在各核團(tuán)中ⅡA組均比ⅠA組增多（均P＜0.01）；B、C組間各核團(tuán)表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠各個(gè)核團(tuán)中SYN的表達(dá)情況（AOD）

3 討論

SYN作為突觸前終末特異性標(biāo)記物，目前常用來(lái)反映突觸的密度、分布及突觸重建。檢測(cè)SYN含量變化是監(jiān)測(cè)神經(jīng)系統(tǒng)突觸形成及其功能狀態(tài)的方法之一，廣泛用于衰老、癡呆、腦缺血、癲癇、神經(jīng)發(fā)育及動(dòng)物模型等研究[6-9]。近年來(lái)，SYN也被應(yīng)用于聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的相關(guān)研究。國(guó)外學(xué)者對(duì)大鼠單側(cè)耳蝸切除或噪音暴露后耳蝸核、下丘中央核、上橄欖核SYN的表達(dá)變化進(jìn)行了研究[10-12]，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者探索了雙側(cè)耳蝸毀損后大鼠聽(tīng)皮層SYN表達(dá)的改變[13]。研究表明，去傳入后聽(tīng)覺(jué)核團(tuán)（耳蝸核、上橄欖核、下丘腦、聽(tīng)皮層）中SYN的表達(dá)都發(fā)生了顯著的改變，說(shuō)明由耳蝸切除所致的去傳入支配，會(huì)導(dǎo)致突觸發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及代謝等方面的變化，包括突觸變性、蛋白合成、突觸重建、由于纖維變性導(dǎo)致的軸突消減以及軸突萌芽[14-16]。

目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到SYN與耳鳴相關(guān)性的研究，本研究結(jié)果可以說(shuō)明以下幾點(diǎn)：（1）耳鳴組大鼠（ⅠA、ⅡA）的耳蝸核、上橄欖核、下丘腦、聽(tīng)皮層中，SYN表達(dá)比對(duì)照組（B組和C組）均明顯增多，這表明在耳鳴動(dòng)物中聽(tīng)覺(jué)中樞的各核團(tuán)的SYN表達(dá)發(fā)生了改變，也就是說(shuō)耳鳴大鼠聽(tīng)覺(jué)通路發(fā)生了突觸重建，突觸功能活躍。由于突觸重建導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)中樞形成了一些異常的突觸連接，從而導(dǎo)致神經(jīng)元放電的增多和異常，這就可能導(dǎo)致了大鼠耳鳴。（2）ⅡA組大鼠SYN的表達(dá)較ⅠA組增多，說(shuō)明隨著水楊酸鈉注射時(shí)間的延長(zhǎng)，劑量的增加，聽(tīng)覺(jué)中樞突觸重建增多。有關(guān)研究表明，臨床上患者服用阿斯匹林幾天后即可能出現(xiàn)耳鳴，隨服用時(shí)間延長(zhǎng)，耳鳴響度持續(xù)[17]。大鼠的行為實(shí)驗(yàn)也提供了給藥幾天后存在耳鳴的依據(jù)，并隨給藥時(shí)程延長(zhǎng)耳鳴響度增加[18]。黃治物等[19]的研究中也觀察到長(zhǎng)期注射水楊酸鹽后出現(xiàn)耳蝸神經(jīng)活動(dòng)的平均譜上升，且隨注射期延長(zhǎng)逐漸增加。因此筆者推測(cè)耳鳴的嚴(yán)重程度隨著水楊酸鹽的使用劑量的增加而增加，其原因可能是隨著注射水楊酸鈉劑量的增加，聽(tīng)覺(jué)中樞突觸重建增多因而加重神經(jīng)元異常放電，突觸的重建可能是耳鳴維持并加重的原因。（3）與空白對(duì)照組相似，0.9%氯化鈉溶液組大鼠SYN表達(dá)水平在四個(gè)核團(tuán)中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明限食、條件反射、嘴部電擊等這些非特異的環(huán)境因素并不能對(duì)大鼠聽(tīng)覺(jué)通路中SYN的表達(dá)造成影響。

綜上所述，水楊酸鈉注射后大鼠聽(tīng)覺(jué)通路（耳蝸核、上橄欖核、下丘腦、聽(tīng)皮層）SYN表達(dá)明顯升高，說(shuō)明水楊酸鈉能夠誘導(dǎo)耳鳴，并引起聽(tīng)覺(jué)通路的神經(jīng)元重塑，說(shuō)明耳鳴與聽(tīng)覺(jué)通路重塑密切相關(guān)，為聽(tīng)覺(jué)通路可塑性在耳鳴的發(fā)生機(jī)制中的作用提供了一個(gè)理論依據(jù)。

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Expression of snaptophysin in rat auditory pathway after sodium salicylate injection

Objective To investigate the expression of synaptophysin in cochlear nucleus,superior olivary nucleus,inferior colliculus and auditory cortex of rats after salicylate injection．Methods Thirty-six Wistar rats were randomly divided into 3 groups:rats in group A received intraperitoneal(i．p)infection of 350 mg/kg sodium salicylate 3h before conditioned response training,while rats in group B received i．p injection of normal saline 3h before conditioned response training,and no conditioned response training and drug injection was given to animals in group C(blank control);the animals were further divided into 6 subgroups(n=6,in each subgroup):AI,BI and CI subgroups received treatment for 7d,subgroups AII,BII and CII for 14d．Samples were collected after animals were sacrificed,the expression of synaptophysin in rat cochlear nucleus,superior olivary nucleus,inferior colliculus and auditory cortex were detected by immunohistochemical technique． Results The expressions of synaptophysin in cochlear nucleus,superior olivary nucleus,hypothalamus and auditory cortex in group A were significantly higher than those in groups B and C(P＜0．01),and the expression of synaptophysin inⅡA group was higher than that inⅠA group in auditory pathway tested(P＜0．01)．Conclusion The tinnius model can be established by injection of sodium salicylate in rats,and the alteration of synaptophysin expression in auditory nucleus provides a experimental basis for the central source of tinnius．

Sodium salicylate Tinnitus Neuronal plasticity Synaptophysin Auditory nuclei

2012-11-13）

（本文編輯：胥昀）

361003 廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（朱艷雙系碩士研究生，現(xiàn)在義烏市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科工作）

朱艷雙，E-mail:502127584@qq.com