呂萍 余江流 韓靜 余齊鳴 王實 鄭智國 凌志強

胃癌組織中Syk基因甲基化狀態(tài)及臨床意義

呂萍 余江流 韓靜 余齊鳴 王實 鄭智國 凌志強

目的 探討胃腺癌患者腫瘤組織、癌旁組織中Syk基因的甲基化狀態(tài)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。 方法 應(yīng)用Real-time甲基化特異性聚合酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)(MSP)檢測92例胃腺癌患者腫瘤組織、配對的癌旁組織中Syk基因的甲基化狀態(tài)，并分析其與臨床病理因素及預(yù)后之間的關(guān)系。選取40例年齡對應(yīng)的健康志愿者及48例非萎縮性胃炎患者胃鏡獲取的組織DNA作對照。結(jié)果 胃腺癌患者腫瘤組織中檢測到Syk基因甲基化有33.7%(31/92)，明顯高于癌旁組織5.4%(5/92)。健康對照者和胃炎患者均無Syk基因甲基化。Syk基因甲基化與腫瘤大小、生長方式、分化程度、是否有靜脈或淋巴管侵犯、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。 結(jié)論 胃腺癌患者Syk基因甲基化與腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)，提示腫瘤進展，預(yù)后不佳。

胃癌 Syk基因 DNA甲基化

既往研究發(fā)現(xiàn)，脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine of kinase，Syk）是一種候選抑癌基因，Syk基因失活與消化道腫瘤、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[1-3]。故推測Syk基因DNA甲基化失活可能在胃癌中也扮演重要角色，但關(guān)于Syk基因甲基化與胃癌關(guān)系的研究鮮有報道。本研究檢測了92例胃癌患者癌組織、癌旁組織中syk的甲基化狀態(tài)，以探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集浙江省腫瘤醫(yī)院2008-01—2009-12的92例診胃腺癌患者的癌組織及癌旁組織，所有病例均經(jīng)術(shù)前胃鏡活檢病理確診，術(shù)后組織標本經(jīng)病理切片診斷證實為胃腺癌。術(shù)前未接受放、化療。其中男53例、女39例，年齡36～73歲，平均53.9歲。腫瘤位置：胃底賁門30例，胃體31例，胃竇31例；腫瘤直徑＜5cm者60例，≥5cm者32例。高、中分化腺癌62例，低分化腺癌30例；腫瘤生長方式：膨脹型20例，浸潤型72例。Hp感染42例，Hp未感染50例。按照2010NCCN指南pTNM分期標準進行術(shù)后病理分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期29例，Ⅲ期37例，Ⅳ期9例。所有患者均由專人進行術(shù)后跟蹤隨訪，具有完整的隨訪資料，以腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或死亡為隨訪終點事件，統(tǒng)計無進展生存期，隨訪截止于2011-06。同期選取88例胃鏡檢查已排除惡性腫瘤者作為對照組，其中40例為健康志愿者，男24例，女16例；48例為非萎縮性胃炎患者，男30例，女18例。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 患者手術(shù)切除標本后，即由專人負責收集標本組織。癌組織標本取自癌灶，癌旁組織距腫瘤邊緣約5cm。對照組為胃鏡活檢組織。切取后立即置于液氮中保存。采用經(jīng)典苯酚、氯仿方法按MagaBio試劑盒說明書提取基因組DNA，并置于-20℃保存[4]。

1.2.2 DNA亞硫酸氫鹽修飾 修飾前先用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，吸光度值（A）260/（A）280比值≥1.8的DNA為合格樣本?；蚪MDNA亞硫酸氫鹽修飾及純化按EpiTect Bisulfite試劑盒（Qiagen）說明書進行操作。

1.2.3 實時定量MSP分析標本甲基化狀態(tài) 根據(jù)Syk基因序列設(shè)計其5′-CpG島特異的甲基化和非甲基化引物如下：Sky_M（F）:5′-CGATTTCGCGGGTTTCGTTC-3′，Sky_M（R）:5′-AAAACGAACGCAACGCGAAA C-3′，擴增產(chǎn)物為243bp；Sky_U（F）:5′-ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG-3′，Sky_U（R）:5′-ACTTCCTTAACACACCCAAAC23′，擴增產(chǎn)物為140bp。所有引物由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系20μl，在ABI7500PCR儀（美國ABI公司）上進行實時熒光MSP分析。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40個循環(huán)；72℃延伸10min。檢測啟動子區(qū)域5′-CpG位點是否處于甲基化狀態(tài)。對每個樣本的甲基化、非甲基化引物進行定量分析，根據(jù)所測CT值通過標準曲線計算各樣本DNA甲基化的拷貝數(shù)。甲基化百分率計算公式如下：甲基化百分率（M%）=100×（甲基化DNA拷貝數(shù)/靶基因DNA總拷貝數(shù)）。靶基因DNA總拷貝數(shù)=甲基化DNA拷貝數(shù)+非甲基化DNA拷貝數(shù)。M%＜20.0%為0分，20.0%≤M%＜40.0%為1分，40.0%≤M%＜60.0%為2分，60.0%≤M%＜80.0%為3分，M%≥80.0%為4分；0分定義為非甲基化、1～3分為部分甲基化，4分為完全甲基化。PCR反應(yīng)結(jié)束后由熔解曲線判定擴增結(jié)果:其中出現(xiàn)甲基化擴增信號,而沒有非甲基化信號的判定為甲基化（M）；出現(xiàn)非甲基化產(chǎn)物信號而沒有甲基化產(chǎn)物信號的判定為非甲基化（U）；同時出現(xiàn)甲基化和非甲基化產(chǎn)物信號的判定為半甲基化（UM）。用在體外經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理過的人類基因組DNA（NEB公司）作為陽性對照、未處理的正常人外周血DNA作為陰性對照,蒸餾水代替模板作為空白對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料各組間率的比較采用χ2檢驗、似然比χ2檢驗或Fisher確切概率法。生存曲線繪制用Kaplan-Meier法，終點事件為腫瘤惡化或患者死亡，觀察無進展生存期。生存曲線比較用Log-Rank檢驗，采用Cox比例風險模型進行多因素生存分析。

2 結(jié)果

2.1 Syk基因甲基化發(fā)生率 92例胃腺癌組織、配對的癌旁組織，40例健康志愿者及48例非萎縮性胃炎患者組織中Syk基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化發(fā)生率分別為 33.7%（31/92）、5.4%（5/92）、0%（0/40）、2.1%（1/ 48）。胃腺癌組與其余3組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 Syk甲基化與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系 Syk基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與腫瘤大小、生長方式、分化程度、浸潤深度、是否有靜脈或淋巴管侵犯、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤生長部位及有否Hp感染無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

2.3 胃腺癌組織中Syk基因甲基化狀態(tài)與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪至第28個月時31例Syk甲基化患者中30例均出現(xiàn)疾病進展或死亡，其中13例甲基化4分者有8例死亡，5例腫瘤進展惡化；4例3分者有1例死亡，3例惡化；14例1～2分者有1例死亡，12例疾病進展。61例Syk非甲基化患者中14例有疾病進展，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。但是將Syk甲基化納入以上病理特征的Cox比例風險模型中，胃癌組織Syk甲基化不能作為影響胃癌患者術(shù)后生存的獨立預(yù)后因素。

3 討論

胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是多基因和表觀遺傳學(xué)共同起作用的結(jié)果，抑癌基因的甲基化失活是最主要的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一。Syk作為公認的候補抑癌基因，與T細胞激活中的ZAP-70屬于同一個蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）家族，位于人類染色體9q22上[5]。DNA甲基化導(dǎo)致Syk表達缺失，機體B細胞激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失控，失去對腫瘤的正常免疫，從而使腫瘤發(fā)生發(fā)展。本研究表明，浸潤性生長的腫瘤比膨脹性生長的腫瘤Syk的甲基化程度高，低分化的胃腺癌組織較高、中分化者甲基化程度高，癌組織浸潤越深甲基化程度越高。同時Syk甲基化與淋巴結(jié)侵犯、靜脈侵犯、腫瘤大小也相關(guān)。表明Syk基因的甲基化與胃癌的分期、進展有關(guān)，Syk的甲基化程度高者，腫瘤分期晚，病情容易進展。然而，Cox比例風險模型表明，Syk甲基化程度不是胃癌的獨立預(yù)后因素，與以往研究[6]相符。要作為胃癌的預(yù)測因子，尚需結(jié)合其它的基因甲基化情況，如TIMP-3、CDH1、p16等等，多基因甲基化在胃癌的發(fā)生中是一早發(fā)事件[4，7]，建立胃癌相關(guān)基因的甲基化譜用于早期診斷和指導(dǎo)預(yù)后是未來發(fā)展方向。

表1 Syk基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)系（例）

圖1 Syk基因甲基化與非甲基化胃癌患者生存曲線

本研究從生存曲線比較，Syk甲基化患者的胃癌術(shù)后無病生存率明顯低于非甲基化患者。且甲基化4分的患者病死率高于1～3分的患者，從一定意義上反映了Syk甲基化程度與胃癌患者的病死率有關(guān)，但需加大樣本量進一步驗證。國外研究資料[6]也發(fā)現(xiàn)細胞核Syk表達的胃癌患者5年存活率高于Sky不表達的患者。

綜上所述，胃癌組織中Syk基因啟動子區(qū)域異常甲基化一定程度上提示腫瘤的分化低分期晚，有轉(zhuǎn)移，可反映疾病進展程度，提示預(yù)后不佳。是否能通過抑制Syk及其它抑癌基因的甲基化達到治療或改善胃癌的預(yù)后[8]，尚需進一步研究說明。

[1]Kanwal S,Kayani M A,Faryal R.Identification of novel SNPs in SYK gene of breast cancer patients:computational analysis of SNPs in the 5'UTR[J].Mol Biol Rep,2012,39(8):8345-8351.

[2]Du Z M,Kou C W,Wang H Y,et al.Clinical significance of elevated spleen tyrosine kinase expression in nasopharyngeal carcinoma[J].Head Neck,2012,34(10):1456-1464.

[3]Zhao S,Sun G,Tony P W,et al.Expression and methylation status of the Syk gene in cervical carcinoma[J].Arch Gynecol Obstet,2011,283(5):1113-1119.

[4]羅君,王新保,余齊鳴,等.胃癌患者術(shù)前腹腔沖洗液中CDH1甲基化狀態(tài)及其臨床意義[J].中華胃腸外科雜志,2012,15（7）:64-68.

[5]Turner M,Mee P J,Costello P S.Perinatal lethality and blocked B-cell development in mice lacking the tyrosine kinase Syk[J].

Nature,1995,378(6554):298-302.

[6]Nakashima H,Natsugoe S,Ishigami S,et al.Clinical significance of nuclear expression of spleen tyrosine kinase (Syk)in gastric cancer[J].Cancer Lett,2006,236(1):89-94.

[7]Kang G H,Shim Y H,Jung H Y,et al.CpG island methylation in premalignant stages of carcinoma[J].Cancer Res,2001,61(7): 2847-2851.

[8]Ding Y B,Xia J G,Chen G Y.Effect of spleen tyrosine kinase expression re-activation by inhibition of DNA methylation on oncogenesis growth of gastric cancer[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2006,9(6):523-526.

Objective To investigate the aberrant methylation of Syk gene in gastric adenocarcinoma and its clinical significance. Methods Real-time methylation-specific polymerase chain reaction (qMSP)was used to examine the methylation status of Syk gene in gastric adenocarcinoma tumor tissue and paired pericancerous gastric mucosa of 92 patients with gastric cancer.The relationship of Syk gene methylation and clinicopathologic features and prognosis of patients was analyzed.Forty age-matched healthy subjects and 48 patients with non-atrophic gastritis served as controls. Results The Syk gene methylation was detected in 31/92(33.7%)cases of gastric adenocarcinoma,which was significantly higher than that in pericancerous mucosa;no methylation was detected in gastric tissue from healthy controls and gastritis patients.Syk gene methylation status were correlated with tumor size,grow pattern,pathological differentiation，TNM stage and invasion of vein and lymphatic vessels (P＜0.05). Conclusion Ectopic methylation of Syk gene is associated with biological behavior of tumor in gastric adenocarcinoma,which may indicates tumor progression and poor prognosis.

Gastric cancerSyk gene DNA methylation

2012-10-11）

（本文編輯：胥昀）

浙江省科技計劃資助項目（2009C33143）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃項目（2011RCA009）

325035 溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院（呂萍、凌志強、余江流、韓靜，呂萍系在職碩士研究生，現(xiàn)在舟山婦幼保健院工作，凌志強系溫州醫(yī)學(xué)院碩士生導(dǎo)師）；浙江省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科（余齊鳴），內(nèi)鏡中心（王實），浙江省腫瘤研究所（鄭智國、凌志強），

凌志強，E-mail:lingzq@hotmail.com