夏西超楊 洪寧黔冀呂 黎呂艷杰

(1.河南師范大學生命科學學院, 新鄉(xiāng) 453007; 2.南陽醫(yī)學高等?？茖W校基礎醫(yī)學院, 南陽 473061)

KK-42對凡納濱對蝦物質儲備相關酶類基因表達的影響

夏西超1,2楊 洪1寧黔冀1呂 黎1呂艷杰1

(1.河南師范大學生命科學學院, 新鄉(xiāng) 453007; 2.南陽醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學院, 南陽 473061)

甲殼動物生長發(fā)育總是與蛻皮聯系在一起的[1]。為了完成蛻皮, 順利實現生長, 甲殼動物在蛻皮間期進行快速大量取食, 臨近蛻皮前取食逐漸減少, 直至蛻皮時停止, 待蛻皮后動物具備了堅硬外殼, 又開始緩慢取食[2?3]。基于對甲殼動物幼體物質儲備的研究, Anger和Dawirs提出不可恢復點(Point of no return, PNR)和飽和儲存點(Point of reserve saturation, PRS)兩個學說, 闡述了物質儲備與蛻皮之間的關系: PNR指在蛻皮過程中, 若物質儲備未到達極限點, 即使再補充餌料也無法使動物順利發(fā)育進入下一個蛻皮周期; PRS指蛻皮前動物物質儲備如果充足, 此時有無餌料供應, 動物都可以順利進入蛻皮周期, 完成正常發(fā)育過程[4]。由此可見, 足夠的營養(yǎng)儲備是啟動甲殼動物蛻皮的前提, 并為順利度過蛻皮后脆弱階段提供能量。該過程涉及多種酶的參與, 如肝胰腺中的胰蛋白酶、組織蛋白酶L、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等[5]。

咪唑類物質KK-42通常被視為是保幼激素的拮抗物,對昆蟲的研究表明, 該類物質作用機理復雜, 其中包括影響幾丁質酶的表達、干擾(或抑制)保幼激素的合成來改變昆蟲的生長速率[6—8]。我們前期研究首次發(fā)現, KK-42能夠促進凡納濱對蝦的生長[9]。鑒于有機物儲備在凡納濱對蝦等甲殼動物生長中的作用, 我們選取了幾種影響有機物儲備的重要酶類, 首次從轉錄水平定量分析了KK-42對這些酶表達的影響, 為闡明KK-42作用的分子機理積累資料。

1 材料與方法

1.1 南美白對蝦的處理

凡納濱對蝦養(yǎng)殖于鞏義市黃河生態(tài)漁業(yè)產業(yè)園。在面積2664 m2(4畝)、水深1.5 m的池塘中, 架設2個面積60 m2、深1.5 m的網箱, 從池塘中采集健康幼蝦(體長3.5—5.0 cm)800頭, 隨機分成2組, 其中一組用1.95×10?4mol/L的KK-42(煙臺大學應用化學系提供, 純度≥95%)溶液浸泡處理1min[7], 取出, 空氣中靜置數秒, 立刻投入到網箱中, 按正常方式養(yǎng)殖; 對照組用不含KK-42的溶液處理, 方法同上。KK-42處理后0、1、2、3、4、5、6、7、8d, 將動物冷凍麻醉, 解剖出肝胰腺, 液氮速凍,?80℃保存。

1.2 mRNA水平的定量測定

RNA提取用RNAiso Plus (TaKaRa)提取凡納濱對蝦肝胰腺總RNA, 總RNA的完整性和純度用凝膠電泳檢測, RNA的濃度根據A260進行定量。

cDNA第一鏈的合成按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)操作說明合成cDNA第一鏈。10 μL反應體系: 5×PrimScriptTMBuffer 2 μL, PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL, Oligo dT Primer (50 mol/L) 0.5 μL, Random 6 mers (100 mol/L) 0.5 μL, 總RNA 100 ng。反應條件: 37℃, 15min, 85℃, 5s。

PCR引物設計根據目的基因和內參基因β-actin保守區(qū)域設計引物, 引物由上海生工公司合成(表1)。

實時熒光定量PCR 20 μL體系中包括: SYRB Premix ExTaqTM(TaKaRa) 10 μL, PCR上下游引物(10 mol/L)各0.4 μL, cDNA模板2 μL, ROX Reference Dye (TaKaRa) 0.4 μL, dH2O 6.8 μL。反應條件: 95℃ 30s, 1 cycle; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40 cycles。測定相關酶基因表達的樣本數為9頭/組/時間點, 重復3次。結果采用2?ΔΔct法進行分析, 實驗所得數據采用unpairedt-test統(tǒng)計分析(P<0.05)。

2 結果

2.1 KK-42對胰蛋白酶、血藍蛋白和組織蛋白酶L表達的誘導

實驗觀察期間, 對照組肝胰腺中胰蛋白酶 mRNA水平相對穩(wěn)定(圖1)。KK-42處理后1—6天, 胰蛋白酶mRNA水平升高42.6%以上, 尤其在第3至第6天達79.9%以上(P<0.01)(圖1), 第7至第8天雖有升高, 但與對照組相比無統(tǒng)計學意義。

在對照組中, 肝胰腺組織蛋白酶L的基因表達水平相比血藍蛋白呈明顯的波動性變化(圖2、圖3)。KK-42處理能顯著誘導血藍蛋白和組織蛋白酶L 的轉錄, 前者mRNA水平在第1、第2、第3、第4、第6和第7天分別提高96.3%、106.2%、382.6%、116.2%、150.0%和202.1%(P<0.01)(圖2); 后者在第4和第7 天升高幅度相對較小, 但也在51.9%以上(圖3)。

2.2 KK-42對肝胰腺α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶表達的抑制

在對照組中, 肝胰腺α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶mRNA水平相對穩(wěn)定(圖4、圖5)。KK-42處理可顯著抑制上述兩種酶mRNA的轉錄, 其中, α-淀粉酶在第1至第7天降幅51.9%以上, 第8天與對照組無顯著性差異(圖4); 在實驗觀察期間, α-葡萄糖苷酶的下調幅度均在57.2%以上(圖5)。

圖1 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺蛋白酶基因表達的誘導Fig.1 The time-course induction of KK-42 on hepatopancreas trypsin mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖2 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺組織蛋白酶L基因表達的誘導Fig.2 The time-course inducation of KK-42 on hepatopancreas cathep sin L mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖3 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺血藍蛋白基因表達的誘導Fig.3 The inducation of KK-42 on hepatopancreas hemocyanin mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖4 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺α-淀粉酶基因表達的抑制Fig.4 The time-course inhibition of KK-42 on hepatopancreas α-amylase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

2.3 KK-42對肝胰腺幾丁質酶和N-乙酰基-β-D-葡萄糖苷酶表達的上調

在對照組中, 幾丁質酶mRNA水平呈明顯波動性變化(圖6), 而N-乙?；?β-D-葡萄糖苷酶基因表達水平與第0天比變化不大(圖7)。KK-42處理后, 幾丁質酶mRNA水平顯著升高, 尤其在第1至第4天分別達到317.1%、627.0%、201.3%和474.3%(P<0.01)(圖6); N-乙?；?β-D-葡萄糖苷酶mRNA含量在第1至第6天升高135.5%以上(P<0.01), 之后與對照組相比無統(tǒng)計學意義上的變化(圖7)。

圖5 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺α-葡萄糖苷酶基因表達的下調Fig.5 The time-course down-regulation of KK-42 on hepatopancreas α-glucosidase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖6 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺幾丁質酶基因表達的上調Fig.6 The up-regulation of KK-42 on hepatopancreas chitinase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖7 KK-42對凡納濱對蝦肝胰腺N-乙?；?β-D-葡萄糖苷酶基因表達的上調Fig.7 The up-regulation of KK-42 on hepatopancreas N-acetyl-β-D-glucosaminidase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

3 討論

充足的物質儲備對啟動甲殼動物蛻皮、促進其生長具有重要作用。我們推測, KK-42的作用機制可能包含在凡納濱對蝦幼蝦物質儲備的某些環(huán)節(jié)中, 據此本論文首先在轉錄水平上分析了與動物蛻皮、生長密切相關的幾種酶的表達變化。

在8d的實驗觀察期間, 對照組胰蛋白酶的表達量相對穩(wěn)定(圖1), 表明凡納濱對蝦生長過程需要不斷從食物中攝取蛋白, 進行分解、吸收和利用。對蝦餌料組分中,粗蛋白的比例高達50%以上, 肝胰腺胰蛋白酶在食物消化過程中起重要作用[10], 與其較高的表達水平相一致。KK-42處理之后, 胰蛋白酶表達量顯著升高(圖1), 這應該有助于機體對蛋白質的消化和儲備。研究發(fā)現, 在無食物可取的情況下, 凡納濱對蝦肝胰腺胰蛋白酶活性會下降40%—60%, mRNA水平降低30%, 動物蛻皮被推遲[11];蛻皮前胰蛋白酶mRNA水平和酶活性都顯著提高, 加速物質儲備并達到飽和點, 為蛻皮奠定物質基礎[11,12]; 處理后第7至第8天, KK-42對胰蛋白酶的誘導效應逐漸減弱, 可能是機體對蛋白質的儲備已達到飽和點。與對照組相比, 處理組肝胰腺組織蛋白酶L mRNA水平明顯升高(圖2), 這可能提高了動物對蛋白質的轉化能力, 有助于動物的生長和蛻皮。據報道, 蛻皮前凡納濱對蝦肝胰腺組織蛋白酶L表達水平明顯升高[13—15]; Chan,et al.采用RNAi技術沉默凡納濱對蝦甲基轉移酶基因的表達, 可抑制動物蛻皮、甚至死亡, 組織蛋白酶L表達也相應降低[13]。KK-42能夠顯著上調肝胰腺血藍蛋白基因的表達(圖3), 這可能與動物取食增加、需氧量上升以及滲透壓調控有關。研究發(fā)現, 在低氧環(huán)境中該蛋白水平降低, 相應地動物取食減少, 生長發(fā)育推遲[13]; 而在蛻皮前, 血藍蛋白合成增加, Cu2+和Zn2+濃度隨之增加, 導致動物體內滲透壓升高, 隨后吸水膨脹, 促使蛻皮[16—18]。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶主要是分解食物中的淀粉,形成D-葡萄糖, 參與維持動物正常的生理功能[19]。在對照組中, α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的表達量較高, 但變化幅度不大(圖4、圖5), 提示凡納濱對蝦幼蝦對淀粉類食物的利用相對穩(wěn)定。在KK42處理后, 二者表達均受到不同程度的抑制, 這可能是動物加大了對蛋白質的利用, 從而減少了淀粉的攝入以及D-葡萄糖的消耗。如前所述, 在同樣條件下, 胰蛋白酶、組織蛋白酶L和血藍蛋白表達增加, 進一步反映了凡納濱對蝦幼蝦在生長發(fā)育過程中對蛋白質和糖類的利用是不平行的[20]。研究表明, 如果動物對淀粉的分解過快, 會導致可溶性單糖水平過高, 可溶性單糖較之氨基酸更易于被動物吸收, 不利于蛋白質的利用和儲備[19]。

已經證明, 昆蟲、甲殼動物體內幾丁質酶和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶的轉錄受蛻皮激素的調控[21—23]。在相同的實驗條件下, 我們發(fā)現在8d的實驗期間, 凡納濱對蝦血淋巴20羥蛻皮酮滴度呈逐漸上升的趨勢(結果未示),與這兩種酶基因表達水平的變化不一致。蛻皮激素化學結構形式多樣, 20羥蛻皮酮僅是其中的一種。我們推測不同動物的幾丁質酶和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶轉錄的調控可能以某種結構的蛻皮激素為主。KK-42處理可提高20羥蛻皮酮滴度(結果未示), 與KK-42對幾丁質酶和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶上調表達結果一致(圖6、圖7), 它們的上調表達, 有助于動物新表皮的合成, 為蛻皮提供物質儲備, 與KK-42的促生長作用相一致。

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THE EFFECT OF KK-42 ON THE EXPRESSION OF NUTRITIONAL STORAGE-ASSOCIATED ENZYMES IN THE SHRIMP LITOPENAEUS VANNAMEI

XIA Xi-Chao1,2, YANG Hong1, NING Qian-Ji1, Lü Li1and Lü Yan-Jie1
(1.College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453002, China; 2.Basic Medical College, Nanyang Medical University, Nanyang 473061, China)

KK-42; 凡納濱對蝦; 物質儲備相關酶; 基因表達

KK-42;Litopenaeus vannamei; Nutritional storage-associated enzymes; Gene expression

Q459

A

1000-3207(2013)02-0388-05

10.7541/2013.32

2011-09-22;

2012-12-17

國家自然科學基金項目(30940008); 高等學校博士學科點專項科研基金(20094104110003); 河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃(2009HASTIT022)資助

夏西超(1977—), 男, 河南南陽人; 博士; 主要從事甲殼動物激素調控研究。E-mail: xiaxichao8336@163.388om

寧黔冀, Tel: 0373-3326340; E-mail: ningqianji1964@163.com