劉永濤艾曉輝索紋紋楊秋紅

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心, 武漢430223; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 無錫 214081; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070)

劉永濤1,2艾曉輝1,2索紋紋1,3楊秋紅1,2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心, 武漢430223; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 無錫 214081; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070)

以7 mg/L的孔雀石綠浸泡斑點叉尾苗種5min后將其飼養(yǎng)于池塘的網(wǎng)箱中, 研究了在養(yǎng)殖模式下孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾苗種各組織中的分布及消除規(guī)律。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分析孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾血液、肌肉、皮膚、肝臟、腎臟組織中的濃度水平。采用藥代動力學(xué)分析軟件3p97對血藥濃度時間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 孔雀石綠和隱色孔雀石綠血藥濃度時間曲線符合有吸收二室模型, 動力學(xué)方程分別為:C孔雀石綠= 683.063 e?0.248t+ 11.176 e?0.006t? 694.239e?0.333t,C隱色孔雀石綠= 757.240 e?0.222t+ 14.474 e?0.007t– 771.714 e?0.382t。血液中孔雀石綠和隱色孔雀石綠達(dá)峰時間Tpeak分別為3.480和3.623h, 峰濃度值Cmax分別為81.560和159.619 ng/mL, 表觀分布容積Vd/F分別為37.689和21.125 L/kg, 分布相的一級速率常數(shù)α分別為0.248和0.222/h, 消除相的一級速率常數(shù)β分別為 0.006和0.007/h, 吸收半衰期T(1/2)α分別為2.794和3.124h, 消除半衰期T(1/2)β分別為113.068和105.841h, 中央室向周邊室轉(zhuǎn)運的一級速率常數(shù)K12分別為0.020和0.015/h, 周邊室向中央室轉(zhuǎn)運的一級速率常數(shù)K21分別為0.159和0.121/h, 藥-時曲線下面積AUC分別為2493.944和3601.863 ng·h/mL。肌肉、皮膚、肝臟和腎臟組織中孔雀石綠和隱色孔雀石綠濃度水平的結(jié)果表明, 孔雀石綠在斑點叉尾4種組織中濃度由高到低的順序是皮膚>肌肉>腎臟>肝臟, 其中斑點叉尾皮膚組織易蓄積孔雀石綠, 其殘留時間最長,肝臟組織由于對孔雀石綠有極強的代謝轉(zhuǎn)化功能而濃度較低?？兹甘G在肌肉、皮膚、肝臟和腎臟組織中的消除方程分別為C= 5.570 e?0.009t、C= 6.302 e?0.007t、C= 4.791 e?0.006t和C= 4.591 e?0.002t, 相關(guān)系數(shù)r2≥0.773,消除半衰期T1/2肌肉、皮膚、肝臟和腎臟分別為3.2、4.1、4.8和14.4d。肌肉、皮膚、肝臟和腎臟組織中孔雀石綠分別在45、60、30和60d才未被檢測到; 隱色孔雀石綠在斑點叉尾4種組織中濃度由高到低的順序是肝臟>皮膚>肌肉>腎臟, 殘留時間最長的組織也是皮膚組織。隱色孔雀石綠在肌肉、皮膚、肝臟和腎臟組織中的消除方程分別為C= 6.491 e?0.004t、C= 6.958 e?0.003t、C= 6.722 e?0.007t和C= 6.162 e?0.002t, 相關(guān)系數(shù)r2≥0.673, 消除半衰期T1/2肌肉、皮膚、肝臟和腎臟分別為7.2、9.6、4.1和14.4d。肌肉、皮膚、肝臟和腎臟組織中隱色孔雀石綠分別在90、90、60和90d才未被檢出。試驗期間(2011年5月17日至7月15日)平均水溫為26.4℃, 孔雀石綠和隱色孔雀石綠90d后在各組織中才未檢測到, 因此, 使用7 mg/L孔雀石綠浸泡2齡斑點叉尾苗種孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠至少應(yīng)經(jīng)過2376℃·d后才能消除。

孔雀石綠; 隱色孔雀石綠; 斑點叉尾; 組織分布; 消除

孔雀石綠是一種N-甲基三苯甲烷類染料, 由于其抗菌效果好, 價格便宜, 容易獲得, 曾被廣泛用于防治水產(chǎn)動物的真菌病、細(xì)菌病和寄生蟲病等[1]。孔雀石綠多用于水產(chǎn)動物的繁殖、消毒和運輸?shù)拳h(huán)節(jié)。由于孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠對人體存在潛在致畸、致癌和致突變的“三致”作用[2—5]。許多國家都將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物, 我國也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中, 禁止用于所有食品動物中。歐盟從來沒有允許孔雀石綠作為獸藥, 美國食品和藥品管理局也沒有批準(zhǔn)使用這種染料[6,7]。從目前國內(nèi)對于鮮活水產(chǎn)品的監(jiān)測情況來看孔雀石綠仍有檢出, 孔雀石綠之所以屢禁不止, 除孔雀石綠抗菌效果好, 價格便宜外, 沒有效果相當(dāng)?shù)奶娲幬锍霈F(xiàn)也是一個重要的原因。目前, 孔雀石綠在水產(chǎn)動物體內(nèi)代謝的報道多是關(guān)于其在水產(chǎn)動物肌肉組織中殘留消除規(guī)律的報道[8—14], 涉及的水產(chǎn)動物主要有鰻鱺、羅非魚、鯽魚、中華絨螯蟹等, 國內(nèi)尚未見關(guān)于孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾體內(nèi)藥代動力學(xué)、組織分布與消除規(guī)律的報道, 國外Plakas, et al.[12]采用靜注和浸泡方式給予斑點叉尾(0.5—0.7 kg)14C標(biāo)記的孔雀石綠0.8 mg/L研究其代謝規(guī)律。由于用藥濃度、用藥時間、魚體規(guī)格及養(yǎng)殖方式的不同孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在魚體內(nèi)代謝規(guī)律會有較大差異。本實驗根據(jù)我國斑點叉尾養(yǎng)殖過程中實際用藥濃度的高限和用藥時間研究了養(yǎng)殖模式下孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾苗種體內(nèi)的藥代動力學(xué)、組織分布與消除規(guī)律。為孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾苗種中的代謝規(guī)律提供了理論數(shù)據(jù), 并為加強該藥物的管理和監(jiān)督非法使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1.2 儀器與色譜條件

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SURYEYOR MS PUMP PLUS, SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS, Thermo TSQ QUANTUM ACCESS MAX)及Thermo LCquan 2.6數(shù)據(jù)采集處理軟件; 自動高速冷凍離心機(日本HITACHI 20PR-520型); Mettler-TOLEDO AE-240型精密電子天平(梅特勒—托利多公司); FS-1高速勻漿機(華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司); 調(diào)速混勻器(上海康華生化儀器制造廠); 氮吹儀(AOSHENG, 杭州奧盛儀器有限公司); 固相萃取裝置(美國, CNW)。

色譜柱: Hypersil Gold C18 (150.0 mm×2.1 mm× 5.0 μm)反相色譜柱; 柱溫: 35℃; 流速0.20 mL/min;進(jìn)樣量 10.0 μL。梯度洗脫條件: A相為乙腈, B相為5 mmol/L乙酸銨溶液用乙酸調(diào)pH 4.5, 0—3.00min, 75% A; 3.00—3.01min, 75% A—90% A; 3.01—8.00min, 90% A; 8.00—8.01min, 75% A; 8.01—10.00min 75% A。

1.3 質(zhì)譜分析條件

離子源: 加熱大氣壓電噴霧離子源(HESI); 離子化模式: 正離子模式; 檢測方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式; 噴霧電壓: 3000 V; 源內(nèi)解離電壓 8 V;鞘氣壓力20 arb; 輔助氣壓力5 arb; 碰撞氣及壓力:氬氣, 1.5 m Torr; 離子傳輸毛細(xì)管溫度: 350℃; Q1 PW 0.7, Q3 PW 0.7。母離子、定性離子對、定量離子對、碰撞能量和管透鏡補償電壓(表1)。

1.4 藥品及試劑

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品(純度>93.5 %, Dr.Ehrenstorfer GmbH); 隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品(純度>92.5 %, Dr.Ehrenstorfer GmbH); 氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0 %, WiTEGA); 氘代隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0 %, WiTEGA); 試劑級孔雀石綠(分析純, 天津市天力化學(xué)試劑有限公司); 乙腈、乙酸(色譜純,美國J.T.Baker); 質(zhì)譜用水(美國, CNW); 乙酸銨(分析純, 美國J.T.Baker), 中性氧化鋁柱(美國, CNW)。

1.5 試驗設(shè)計與采樣

藥液的配制: 稱取0.63 g孔雀石綠試劑, 溶于90 L水中配制成7 mg/L的孔雀石綠溶液中置于125 L塑料箱中。

表1 孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠質(zhì)譜條件Tab.1 MS parameters of MG, MG-D5, LMG and LMG-D6

另設(shè)一對照組, 定期采集樣品進(jìn)行分析。

1.6 樣品預(yù)處理

血液、肝臟、腎臟、皮膚樣品的處理 參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》進(jìn)行測定, 略有改動。將冷凍保存的血液、肝臟、腎臟和皮膚樣品室溫下自然解凍, 將每個時間點的腎臟樣品合并為一個樣品取樣量約為0.5 g, 取1.0 mL血液, 1.0 g肝臟、皮膚于10 mL塑料離心管中, 加入80 μL, 100 μg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液, 加入4 mL乙腈, 振蕩30s, 8000 r/min離心5min, 轉(zhuǎn)移到10 mL具塞刻度離心管 再加入4 mL乙腈, 振蕩30s, 離心后, 合并提取液于10 mL具塞刻度離心管, 用乙腈定溶至10 mL。取5 mL提取液過中性氧化鋁柱, 用4 mL 乙腈洗中性氧化鋁柱。將其置于45℃氮吹儀上吹至1 mL, 在加入1 mL pH 4.5乙酸銨溶液, 渦旋振蕩30s, 超聲提取1min, 取1 mL過0.22 μm濾頭過濾后, 上HPLC/MS/MS分析。

肌肉樣品的處理 按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》進(jìn)行測定。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及回收率與精密度測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備: 配制含氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠為內(nèi)標(biāo), 孔雀石綠和隱色孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、10、20 ng/mL的低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線; 配制含氘代孔雀石綠內(nèi)標(biāo)和氘代隱色孔雀石綠內(nèi)標(biāo), 孔雀石綠和隱色孔雀石綠濃度為50、100、200、500、1000 ng/mL的高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。作HPLC/MS/MS分析, 以測得的孔雀石綠與氘代孔雀石綠和隱色孔雀石綠與氘代隱色孔雀石綠面積的比值X為橫坐標(biāo)和孔雀石綠和隱色孔雀石綠濃度Y為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。用空白組織制成低質(zhì)量濃度藥物的含藥組織, 經(jīng)預(yù)處理后測定, 將引起3倍基線噪音的藥物的質(zhì)量濃度定義為最低檢測限。

回收率與精密度測定: 回收率= Cr/C0×100%,其中Cr為用空白血液、肌肉肝臟、皮膚、腎臟組織中加入一定量的孔雀石綠和隱色孔雀石綠已知標(biāo)準(zhǔn)溶液, 再按樣品預(yù)處理方法進(jìn)樣后, 測定孔雀石綠和隱色孔雀石綠的質(zhì)量濃度; C0為加入一定量的孔雀石綠和隱色孔雀石綠已知標(biāo)準(zhǔn)溶液。在5種空白組織中分別添加4個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 使組織中質(zhì)量濃度分別為1.0、20.0、50.0、500和1000 μg/kg,血液為1.0、10.00、50.0、200和500 μg/L。每個濃度的樣品, 日內(nèi)做5個重復(fù), 一周內(nèi)重復(fù)做5次, 計算日內(nèi)及日間精密度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

藥物動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算采用中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)專業(yè)委員會編制的3P97藥動軟件分析; 標(biāo)準(zhǔn)曲線, 藥物經(jīng)時曲線圖, 消除方程計算和回歸圖,采用Microsoft Excel 2003, 進(jìn)行計算和繪制。消除方程采用C=C0e-kt, C表示藥物濃度, C0為殘留消除對數(shù)曲線的截距(μg/kg), k 表示消除速率常數(shù)[17]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)

在0.25—20.0 ng/mL和50.0—1000.0 ng/mL范圍內(nèi)孔雀石綠和隱色孔雀石綠線性關(guān)系良好, 低濃度線性方程分別為Y=0.07759+0.5499X, Y=0.1696+ 1.777X; 高濃度線性方程分別為Y=0.6803+7.108X, Y=1.230+11.652X; 相關(guān)指數(shù)均大于0.9988。

2.2 方法檢測限、回收率與精密度

在本實驗條件下, 血液、肌肉、肝臟、腎臟和皮膚組織中孔雀石綠和隱色孔雀石綠方法檢測限均為0.5、0.5 μg/kg。各組織中5個質(zhì)量濃度加標(biāo)水平的孔雀石綠和隱色孔雀石綠平均回收率為92.27%—110.67%, 測得的日內(nèi)精密度與日間精密度均小于10%。

2.3 孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉

將測到的孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的峰面積分別與其氘代同位素內(nèi)標(biāo)峰面的比值, 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程, 可以求出孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾血液中的濃度值(表2)。由表2可以看出, 孔雀石綠和隱色孔雀石綠峰濃度分別出現(xiàn)在4和6h, 濃度分別為(118.16±30.95)和(203.20±24.25) μg/L, 0.5h后孔雀石綠的代謝物隱色孔雀石綠濃度高于孔雀石綠的濃度(圖1), 在1080h后孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠才檢測不到。

表 2 7 mg/L孔雀石綠浸泡后孔雀石綠及其代謝物在斑點叉尾血液中的濃度(ng/mL, n=5)Tab.2 The concentrations of GM and its metabolite LMG in channel catfish blood after 7 mg/L GM bath n=5

表 2 7 mg/L孔雀石綠浸泡后孔雀石綠及其代謝物在斑點叉尾血液中的濃度(ng/mL, n=5)Tab.2 The concentrations of GM and its metabolite LMG in channel catfish blood after 7 mg/L GM bath n=5

時間Time (h)孔雀石綠MG隱色孔雀石綠LMG 0.25 88.10±26.99 18.75±10.89 0.5 46.05±15.59 81.79±14.23 1 39.58±13.65 78.33±28.45 2 88.22±6.34 118.31±49.02 4 118.16±30.95 176.06±51.77 6 88.18±13.60 203.20±24.25 8 61.26±10.16 140.41±24.67 12 18.87±7.44 34.84±20.37 24 15.44±7.89 54.89±15.25 48 10.41±7.39 9.00±6.52 96 5.38±0.84 12.77±10.84 192 4.87±1.40 2.83±3.51 288 2.78±2.78 5.78±3.04 384 2.91±1.72 0.70±0.58 480 5.45±1.23 8.86±7.61 720 1.20±0.99 2.92±1.21 1080 ND ND 1440 ND ND

表3 7 mg/L的孔雀石綠浸泡斑點叉尾孔雀石綠及隱色孔雀石綠在其體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters for MG and LMG in channel catfish after water bath administration of 7 mg/L

表3 7 mg/L的孔雀石綠浸泡斑點叉尾孔雀石綠及隱色孔雀石綠在其體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters for MG and LMG in channel catfish after water bath administration of 7 mg/L

注: A, B為藥時曲線對數(shù)圖上曲線在橫軸和縱軸上的截距Drug concentration-time curve on logarithmic graph curve on the horizontal axis and vertical axis intercept; α, β分別為分布相、消除相的一級速率常數(shù)First-order rate constant for drug distribution and elimination phase; K21由周邊室向中央室轉(zhuǎn)運的一級速率常數(shù)First-order rate constant for drug distribution from peripheral compartment to central compartment; K10由中央室消除的一級速率常數(shù)First-order rate constant for drug elimination from central compartment; K12由中央室向周邊室轉(zhuǎn)運的一級速率常數(shù)First-order rate constant for drug distribution from central compartment to peripheral compartment; Vd/F 表觀分布容積Apparent volume of distribution; AUC藥-時曲線下面積Area under concentration-time curve; Lag time 滯后時間; Ka為一級吸收速率常數(shù)First-order rate constant for drug absorption; T(1/2)Ka為藥物在中央室的吸收半衰期Absorption half-life in central compartment; T(1/2)α、T(1/2)β分別為總的吸收和消除半衰期The overall absorption half-life and Elimination half-life; Tpeak出現(xiàn)最高血藥質(zhì)量濃度的時間The time at highest peak of concentration; Cmax最高血藥質(zhì)量濃度The biggest concentration of the drug in blood; CL(s)為總體清除率The overall clearance rate

參數(shù)Parameters單位Unit孔雀石綠MG隱色孔雀石綠LMG A ng/mL 683.063 757.240 α 1/h 0.248 0.222 B ng/mL 11.176 14.474 β 1/h 0.006 0.007 Ka1/h 0.333 0.382 Lag time h 0.017 0.080 Vd/F L/kg 37.689 21.125 T(1/2)αh 2.794 3.124 T(1/2)βh 113.068 105.841 T(1/2)Kah 2.079 1.816 K211/h 0.020 0.015 K101/h 0.074 0.092 K121/h 0.159 0.121 AUC ng·h/mL 2493.944 3601.863 CL(s) (L/h)/kg 0.002 0.003 Tpeakh 3.480 3.623 Cmaxng/mL 81.506 159.619

數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理得到肌肉組織中藥物濃度(C)與時間(t)關(guān)系的消除曲線方程、相關(guān)系數(shù)(r2)及消除半衰期(T1/2), (表6、7)?？兹甘G在4種組織中的消除半衰期T1/2(d)腎臟>肝臟>皮膚>肌肉; 隱色孔雀石綠在4種組織中的消除半衰期T1/2(d)腎臟>皮膚>肌肉>肝臟。

圖1 孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在斑點叉尾血液中的代謝規(guī)律Fig.1 The depletion of MG and LMG in blood of channel catfish

3 討論

影響孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留的主要因素有用藥時間、用藥濃度、水產(chǎn)動物種類、水溫、pH等。彭景書等[14]采用3種濃度(0.1、0.2、0.15 mg/L) 的孔雀石綠浸泡青石斑魚5h和連續(xù)浸泡3次, 1次/d,15min/次, 結(jié)果表明, 在浸泡濃度相同的條件下連續(xù)浸泡3次, 15min/次組中孔雀石綠在青石斑魚肌肉組織中的殘留濃度和殘留時間均小于浸泡5h組; 當(dāng)采用不同濃度(和0.15 mg/L)時連續(xù)浸泡3次, 1次/d, 15min/次(0.15 mg/L組)孔雀石綠殘留濃度和殘留時間仍小于浸泡5h組(0.15 mg/L)可以看出浸泡時間對孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留量及殘留時間影響較大, 高露嬌等[11]采用0.1和0.2 mg/L的孔雀石綠藥浴歐洲鰻鱺24h后轉(zhuǎn)移至清水中孔雀石綠在鰻鱺肌肉中的殘留時間>120d。曲志娜等[15]采用0.8 mg/L的孔雀石綠浸泡大菱鲆1h后采集大菱鲆的肌肉組織進(jìn)行分析, 結(jié)果表明, 孔雀石綠降至檢測限以下需要20.3d, 而其代謝物隱色孔雀石綠消除則要281.9— 356.7d。由以上報道可以看出除不同水產(chǎn)動物以外, 浸泡用藥的時間對于孔雀石綠殘留的影響較大。本實驗按照水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中苗種下塘前孔雀石綠作為消毒劑對其進(jìn)行浸泡消毒的方式給藥, 采用實際應(yīng)用濃度的上限7 mg/L的濃度, 浸泡5min后將斑點叉尾魚苗養(yǎng)殖在池塘的網(wǎng)箱中。

表4 7 mg/L孔雀石綠浸泡斑點叉尾孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在各組織中的濃度Tab.4 The concentrations (μg/kg) of MG and LMG residues in various tissues of channel catfish (n=5)

表4 7 mg/L孔雀石綠浸泡斑點叉尾孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在各組織中的濃度Tab.4 The concentrations (μg/kg) of MG and LMG residues in various tissues of channel catfish (n=5)

時間Time (h) 肌肉Muscle 皮膚Skin 肝臟Liver肌肉Muscle 皮膚Skin 肝臟Liver孔雀石綠MG 隱色孔雀石綠LMG0.25 413.8±119.5 509.3±292.0 154.8±55.4 709.4±209.5 709.0±165.5 5448.4±1721.6 0.5 441.0±52.8 692.1±283.6 242.2±73.5 837.0±64.5 669.9±218.3 5583.8±1545.0 1 487.7±142.5 707.1±362.9 120.9±34.6 805.1±126.7 590.5±189.6 5109.4±1107.0 2 379.6±170.1 1459.9±1161.6 103.0±56.6 672.9±144.9 750.4±189.6 3010.1±1622.9 4 305.6±88.7 2032.3±932.7 139.4±61.0 759.8±58.6 882.4±766.6 2326.2±892.9 6 402.0±116.2 2208.4±1224.0 63.5±26.9 663.7±27.1 839.1±360.5 1117.4±422.4 8 411.7±110.2 1396.5±791.1 110.5±29.8 868.2±199.7 1206.1±217.5 988.3±5.83 12 307.8±174.5 1378.1±798.0 110.9±61.7 481.2±227.8 934.2±181.3 347.7±20.0 24 122.8±37.8 334.8±54.6 85.3±31.0 422.1±54.4 1078.5±502.1 205.0±6.53 48 116.7±99.1 220.8±55.2 93.8±17.8 420.6±42.7 914.6±148.3 105.0±22.3 96 35.5±28.5 73.3±22.5 71.1±59.7 357.8±196.3 1086.9±5.54 69.9±17.4 192 9.35±0.18 13.84±1.80 30.1±14.0 191.1±49.0 864.2±34.3 74.5±18.0 288 7.03±5.35 9.27±3.30 16.7±0.31 185.9±116.3 720.4±27.8 48.8±32.8 384 7.76±2.00 6.82±2.22 11.6±8.36 233.1±108.0 687.4±152.0 24.0±2.30 480 5.35±0.53 7.60±0.89 8.36±2.31 159.4±60.0 454.4±15.7 35.8±12.0 720 0.72±0.24 2.13±0.15 ND 17.5±5.12 97.7±53.5 7.12±3.54 1080 ND 0.60±0.072 ND 8.01±6.01 15.28±8.61 1.762±0.32 1440 ND ND ND 1.04±0.63 4.32±1.97 ND 2160 ND ND ND ND ND ND

表5 7 mg/L孔雀石綠浸泡后孔雀石綠及其代謝物在斑點叉尾腎臟中的濃度(μg/kg)Tab.5 The concentrations (μg/kg) of GM and its metabolite LMG in channel catfish kidney after 7 mg/L GM bath

表5 7 mg/L孔雀石綠浸泡后孔雀石綠及其代謝物在斑點叉尾腎臟中的濃度(μg/kg)Tab.5 The concentrations (μg/kg) of GM and its metabolite LMG in channel catfish kidney after 7 mg/L GM bath

時 間 Time (h) 孔雀石綠 MG 隱色孔雀石綠 LMG 0.25 255.45 84.90 0.5 270.13 101.24 1 117.91 99.31 2 118.25 156.23 4 102.26 174.43 6 65.91 208.36 8 117.79 301.81 12 93.86 331.50 24 60.00 279.53 48 76.89 362.69 96 89.08 338.71 192 41.07 326.33 288 27.73 222.06 384 35.71 324.28 480 29.82 138.42 720 31.30 41.88 1080 7.88 11.43 1440 ND 2.14 2160 ND ND

圖2 孔雀石綠及其代謝物在斑點叉尾腎臟中的代謝規(guī)律Fig.2 The depletion of MG and LMG in kidney of channel catfish

圖3 孔雀石綠在斑點叉尾各組織中的分布與消除規(guī)律Fig.3 The distribution and depletion of MG in tissues of channel catfish

表6 7 mg/L孔雀石綠浸泡斑點叉尾孔雀石綠在各組織中消除曲線方程及相關(guān)系數(shù)Tab.6 The equation of elimination curve and correlation index of MG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

表6 7 mg/L孔雀石綠浸泡斑點叉尾孔雀石綠在各組織中消除曲線方程及相關(guān)系數(shù)Tab.6 The equation of elimination curve and correlation index of MG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

組織Tissue方程Equation相關(guān)系數(shù) r2Correlation coefficient消除半衰期T1/2(d)肌肉 MuscleC= 5.570 e-0.009t0.887 3.2皮膚 Skin C= 6.302 e-0.007t0.811 4.1肝臟 Liver C= 4.791 e-0.006t0.916 4.8腎臟 KidneyC= 4.591 e-0.002t0.773 14.4

表7 7 mg/L孔雀石綠浸泡斑點叉尾隱色孔雀石綠在各組織中消除曲線方程及相關(guān)系數(shù)Tab.7 The equation of elimination curve and correlation index of LMG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

表7 7 mg/L孔雀石綠浸泡斑點叉尾隱色孔雀石綠在各組織中消除曲線方程及相關(guān)系數(shù)Tab.7 The equation of elimination curve and correlation index of LMG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

組織Tissue方程Equation相關(guān)系數(shù)r2Correlation coefficient消除半衰期T1/2(d)肌肉 MuscleC= 6.491 e-0.004t0.936 7.2皮膚 Skin C= 6.958 e-0.003t0.828 9.6肝臟 Liver C= 6.722 e-0.007t0.673 4.1腎臟 KidneyC= 6.162 e-0.002t0.891 14.4

國內(nèi)外關(guān)于孔雀石綠在水產(chǎn)動物體內(nèi)藥代動力學(xué)特征的報道較少, 在本實驗條件下孔雀石綠以7 mg/L的濃度浸泡斑點叉尾后, 孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠藥時數(shù)據(jù)經(jīng)3p97實用藥代動力學(xué)分析軟件分析, 血液中藥物濃度與時間關(guān)系符合有吸收二室模型, 孔雀石綠和隱色孔雀石綠動力學(xué)方程分別為:

圖4 隱色孔雀石綠在斑點叉尾各組織中的分布與消除規(guī)律Fig.4 The distribution and depletion of LMG in tissues of channel catfish

圖5 0.25 ng/mL MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.5 SRM chromatograms of 0.25 ng/mL MG and LMG mixed standard

圖6 45d腎臟中LMG和LMG選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.6 SRM chromatograms of MG and LMG in kidney at 45d

孔雀石綠和隱色孔雀石綠的表觀分布容積(Vd/F)分別為37.689和21.125 L/kg, 兩者均大于1 L/kg說明孔雀石綠及其代謝物主要分布在血液以外的組織這與Plaska, et al.[12]報道的孔雀石綠有較強的血管外分布的能力相符?？兹甘G通過浸泡方式進(jìn)入斑點叉尾體內(nèi)進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán), 孔雀石綠的達(dá)峰時間為3.480h, 濃度為81.506 ng/mL, 吸收速率為0.333/h, 分布半衰期為2.794h, 消除半衰期較長(113.068h)與藥物分布量的曲線下面積(AUC)較大(2493.944 ng·h/mL)兩者是相關(guān)的。K21

中的分布規(guī)律

目前, 關(guān)于孔雀石綠及其代謝物在水產(chǎn)動物體內(nèi)各組織中分布與消除規(guī)律的報道較少, 多數(shù)僅研究了水產(chǎn)動物肌肉組織中孔雀石綠和隱色孔雀石綠消除規(guī)律[8—10,13—15]。本實驗研究了孔雀石綠在斑點叉尾皮膚、肝臟、腎臟和肌肉4種組織中的分布與消除過程, 孔雀石綠在斑點叉尾4種組織中濃度由高到低的順序是皮膚>肌肉>腎臟>肝臟, 其中斑點叉尾皮膚組織易蓄積孔雀石綠, 其殘留時間最長, 肝臟組織由于對孔雀石綠有極強的代謝轉(zhuǎn)化功能而濃度較低; 隱色孔雀石綠在斑點叉尾4種組織中濃度由高到低的順序是肝臟>皮膚>肌肉>腎臟, 殘留時間最長的組織也是皮膚組織。從孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在各組織的消除半衰期來看皮膚組織消除半衰期T1/2較長分別為4.1和9.6d,而孔雀石綠和隱色孔雀石綠在肌肉組織中的消除半衰期T1/23.2和7.2d, 這可能與斑點叉尾皮膚組織中含有較多脂肪, 而孔雀石綠具有親脂性有關(guān)。目前, 我國對于水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的監(jiān)控主要是魚體的可食組織-肌肉組織, 從實驗結(jié)果可以看出孔雀石綠和隱色孔雀石綠易在皮膚組織中蓄積, 而且消除時間也相對較長, 建議相關(guān)部門將水產(chǎn)動物的可食組織皮膚和肌肉一起列為檢測靶組織。試驗期間(2011年5月17日至2011年7月15日)平均水溫為26.4℃, 因此, 使用7 mg/L孔雀石綠浸泡2齡斑點叉尾苗種孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠至少應(yīng)經(jīng)過2376℃·d后才能消除。

圖7 45d 肌肉中MG和LMG選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.7 SRM chromatograms of MG and LMG in muscle at 45d

圖8 45d皮膚中LMG和LMG選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.8 SRM chromatograms of MG and LMG in skin at 45d

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TISSUE DISTRIBUTION AND ELIMINATION OF MALACHITE GREEN AND ITS METABOLITE LEUCOMALACHITE GREEN FROM CHANNEL CATFISH (IETALURUS PUNETAUS) AFTER BATH TREATMENT

LIU Yong-Tao1,2, AI Xiao-Hui1,2, SUO Wen-Wen1,3and YANG Qiu-Hong1,2
(1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Freshwater Fish Germplasm Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Wuhan 430223, China; 2.Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Science, Wuxi 214081, China; 3.College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The distribution and depletion rules of MG and its metabolite LMG in channel catfish was investigated after bath treatment of 7 mg/L MG.Channel catfish were raised in the cages in the pool.Blood, muscle, liver, skin and kidney of channel catfish were analyzed by HPLC/MS/MS.The data of drug concentration-time were analyzed using pharmacokinetics software 3p97.The results showed that blood concentration-time data of MG and LMG were both best fitted using a two-compartment model with first absorption.The pharmacokinetic equations were CMG=683.063 e?0.248t+11.176 e?0.006t? 694.239 e?0.333tand CLMG=757.240 e?0.222t+14.474 e?0.007t– 771.714 e?0.382t.Peak concentrations of MG and LMG were 81.560 ng/mL and 159.619 ng/mL at 3.480h and 3.623h, respectively.The distribution volume (Vd/F) of MG and LMG were 37.689 L/kg and 21.125 L/kg, respectively.First-order rate constants for MG and LMG distribution phases (α) were 0.248/h and 0.222/h, respectively, First-order rate constants for MG and LMG elimination phases (β) were 0.006/h and 0.007/h respectively.The absorption half-lifeT(1/2)αwere 2.794h and 3.124h, respectively.The elimination half-lifeT(1/2)βwere 113.068h and 105.841h respectively.First-order rate constants for MG and LMG distributions from central compartment to peripheral compartment (K12) were 0.020/h and 0.015/h respectively.First-order rate constants for MG and LMG distributions from peripheral compartment to central compartment (K21) were 0.159/h and 0.121/h, respectively.The areas under the curve (AUC) were 2493.944 ng·h/mL and 3601.863 ng·h/mL.The results of MG and LMG concentrations in muscle, skin, liver and kidney of channel catfish showed that the orders of 4 kinds of tissues concentration levels of MG from high to low were skin, muscle, kidney and liver.MG was easy to accumulate in skin, and residue time was the longest.Because MG was metabolited by liver fastly, low concentrations of MG were determined in liver.The Elimination equations of MG in muscle, skin, liver and kidney were C= 5.570 e?0.009t, C= 6.302 e?0.007t, C= 4.791 e?0.006tand C= 4.591 e?0.002t.Those correlation coefficients (r2) were ≥0.773 respectively.The elimination half-life (T1/2) of MG in muscle, skin, liver and kidney were 3.2d, 4.1d, 4.8d and 14.4d, respectively.MG was not detected in muscle, skin, liver and kidney of channel catfish at 45d, 60d, 30d and 60d respectively.The orders of 4 kinds of tissues concentration levels of LMG from high to low were liver, skin, muscle kidney.The tissue with the longest residue time of LMG was also skin.The Elimination equations of LMG in muscle, skin, liver and kidney were C= 6.491 e?0.004t,C= 6.958 e?0.003t,C= 6.722 e?0.007t, andC= 6.162 e?0.002t, repectively.The correlation coefficients (r2) of them were ≥0.673.The elimination half-life of MG in muscle, skin, liver and kidney were 7.2d, 9.6d, 4.1d and 14.4d.LMG was not detected in muscle, skin, liver and kidney of channel catfish at 90d, 90d, 60d and 90d, respectively.MG and LMG were not detected at 90d and the average water temperature was 26.4℃ during the experiment from May 17, 2011 to July 15, 2011.Malachite green and its metabolite Leucomalachite green should at least through 2376℃·d to eliminate at 7 mg/L malachite green for 2 age of channel catfish.

Malachite green; Leucomalachite green; Channel catfish (Ietalurus punetaus); Tissue distribution; Elimination

S948

A

1000-3207(2013)02-0269-12

10.7541/2013.14

2012-02-13;

2012-11-20

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費項目“3種禁藥在主要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的殘留評估”(2011C008); 2011年農(nóng)業(yè)部財政項目“水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測”; 中央及公益性研究院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2011JBFA19)資助

劉永濤(1979—), 男, 山東濰坊人; 在讀博士, 助理研究員; 主要從事水產(chǎn)藥理及檢測技術(shù)研究。E-mail: thincat2005@ sina.com

艾曉輝, 博士, 研究員; E-mail: aixh@yfi.ac.cn