黃偉超胡晗華

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微擬球藻屬對鹽度的耐受及其產(chǎn)油特性分析

黃偉超1,2胡晗華1

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微擬球藻(Nannochloropsis)是一類屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)、球形或近似球形的單細(xì)胞真核生物,其細(xì)胞小(通常2—4 μm), 形態(tài)簡單, 僅憑形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)很難確定其分類地位。然而, 與其他真核微藻顯著不同的是, 該屬的種類除葉綠素a外, 并不含有其他類型的葉綠素[1]。自Hibberd[2]首先描述微擬球藻屬以來,該屬大約有6個(gè)已定種, 分別是: 加的斯微擬球藻(N.gaditana)、顆粒微擬球藻(N.granulata)、湖泊微擬球藻(N.limnetica)、海洋微擬球藻(N.oceanica)、眼點(diǎn)微擬球藻(N.oculata)和鹽生微擬球藻(N.salina)。該屬的種類多為海生或鹽生[3], 但也常見于淡水環(huán)境中[4]。由于微擬球藻屬的種類含有高的多不飽和脂肪酸, 特別是二十碳五烯酸(EPA),而被認(rèn)為是工業(yè)化生產(chǎn)EPA的最佳原料[5]。此外, 微擬球藻還能作為魚類幼體和輪蟲的餌料甚至是人類的食品。

自20世紀(jì)末以來, 由于全球性能源短缺以及CO2排放引起的溫室效應(yīng)使得對于可再生能源的開發(fā)和利用受到了廣泛的關(guān)注。在多種可再生能源中, 按能源當(dāng)量, 生物質(zhì)能源僅次于煤炭、石油和天然氣列第四位, 是國際公認(rèn)緩解能源危機(jī)的有效途徑之一。生物柴油是生物質(zhì)能的一種, 它是以生物體油脂為原料, 經(jīng)轉(zhuǎn)酯作用而形成的單烷基脂肪酸酯, 是一種優(yōu)質(zhì)清潔柴油。發(fā)展生物柴油,原料是關(guān)鍵。微藻被認(rèn)為是最具潛力、能實(shí)現(xiàn)可持續(xù)供給的油脂生物質(zhì)資源之一, 利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有多種優(yōu)勢。在眾多的產(chǎn)油微藻中, 微擬球藻由于具有高的光合作用效率、生物量、油脂含量以及具有成熟的大規(guī)模封閉式光生物反應(yīng)器和開放池的戶外培養(yǎng)體系, 而被認(rèn)為是最有潛力的工業(yè)產(chǎn)油的模式研究藻種[6]。其中鹽生微擬球藻、眼點(diǎn)微擬球藻和加的斯微擬球藻由于具有相對較高的總脂含量而被研究得較為詳盡[7—9]。特別是, 加的斯微擬球藻因表現(xiàn)出較廣的鹽度(10%—120%的海水鹽度)和pH(7—10)耐受性, 在光自養(yǎng)條件下有高的生物量(>10 g/L)、對數(shù)期也能合成甘油三酯, 而被作為研究微藻產(chǎn)油的最佳模式生物, 目前其遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立, 全基因組序列已公布[10]。本研究以6種7株微擬球藻為對象,分析其對鹽度的耐受性, 比較中性脂的組成和含量, 然后,從中選取兩個(gè)油含量較高、目前應(yīng)用較廣的兩株微擬球藻, 進(jìn)一步研究批量培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞油脂的積累規(guī)律和脂肪酸組成, 為利用微擬球藻作為生產(chǎn)生物柴油的原料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)

兩株海洋微擬球藻(Nannochloropsis oceanica) MBIC10090和PP983分別來自日本生物資源中心(NBRC)和國家海洋局第一海洋研究所李瑞香實(shí)驗(yàn)室, 顆粒微擬球藻(N.granulataMBIC10054)和鹽生微擬球藻(N.salinaMBIC10063)購自日本生物資源中心, 眼點(diǎn)微擬球藻(N.oculataCCAP 849/1)和加的斯微擬球藻(N.gaditanaCCAP 849/5)購自英國藻類和原生動物培養(yǎng)中心(CCAP),湖泊微擬球藻(N.limneticaKR 1998/3)由德國Lothar Krienitz教授提供。除屬于淡水的湖泊微擬球藻用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)外, 其他的海洋種類均用f/2AW培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 藻株在海水和淡水中生長的比較

為便于比較, 先將屬于海洋的6個(gè)藻株接種于BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少兩代至對數(shù)生長期, 然后, 再分別將生長在BG11或f/2AW培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞離心收集, 對應(yīng)接種至含6 mL BG11或f/2AW培養(yǎng)基的15 mL培養(yǎng)試管中; 對于淡水種類而言, 由于預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示其不能生長在海水中, 因而比較時(shí)直接利用生長于BG11培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞接種, 接種起始A730=0.1。靜置培養(yǎng)在20℃、光強(qiáng)為60 μmol photons/(m2·s)的連續(xù)光照下進(jìn)行, 每天至少搖動試管2—3次, 7d后測定A730值及葉綠素a的含量。葉綠素a的含量按照Parsons和Strickland[11]的方法(在90% 的丙酮中)用公式計(jì)算: Chl.a (mg/L)=11.41×A664。

1.3 藻株中性脂含量分析

6株海洋的微擬球藻和1株淡水的微擬球藻分別生長在含400 mL f/2AW和BG11培養(yǎng)基(將氮濃度減少到882 μmol/L NaNO3, 與f/2培養(yǎng)基中的氮濃度一致)的500 mL三角瓶中, 在22℃、100 μmol photons/(m2·s)的連續(xù)光照條件下靜置培養(yǎng)20d至穩(wěn)定期, 收獲藻細(xì)胞提取總脂利用薄層層析法比較中性脂的組成及含量。

藻細(xì)胞的總脂按照Bligh和Dyer[12]的方法提取。經(jīng)6000 r/min離心收集的藻細(xì)胞加入一定體積的氯仿∶甲醇(1∶1), 在旋渦振蕩器上以最大速度振蕩1—2 min, 然后加入3/10體積的1 mol/L氯化鉀的0.2 mol/L磷酸溶液, 稍振蕩后12000 r/min離心5min, 吸取下層氯仿相至新的EP管中, 置于通風(fēng)廚中吹干, ?20℃保存?zhèn)溆?。薄層層析參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。薄層層析板的型號是Silica gel 60 F254 (Merk KgaA Darmstadt, Germany), 展層劑體系為正己烷∶乙醚∶乙酸(70∶30∶1,v∶v∶v)。展層完畢從展層缸中取出層析板, 置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干展層劑, 然后放置到含有一定量顆粒碘的燒杯中于37℃ 下顯色5—10 min[14]。標(biāo)準(zhǔn)品甘油一硬脂酸酯(Monostearin)、甘油二硬脂酸酯(Distearin)和三油酸甘油酯(Glyceryl trioleate)購自Sigma公司。

1.4 藻株油脂積累分析

將處于對數(shù)生長期的眼點(diǎn)微擬球藻和加的斯微擬球藻接種到含400 mL f/2AW培養(yǎng)基(將氮濃度減少到500 μmol/L NaNO3)的500 mL三角瓶中, 在22℃、光強(qiáng)為60 μmol photons/(m2·s)的條件下通空氣培養(yǎng), 每天取樣通過尼羅紅染色[15]后, 用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度, 以反映藻細(xì)胞中性脂含量的變化情況, 分析前以A730值為基準(zhǔn)調(diào)整取樣的體積。同時(shí), 測定培養(yǎng)液的A730值和利用分光光度法(A220)檢測NO3?的濃度[16]。培養(yǎng)10d后的藻細(xì)胞收集用于測定總脂含量及其脂肪酸組成。

1.5 總脂含量的測定及脂肪酸組成分析

6000 r/min離心收集藻細(xì)胞, 用滅菌ddH2O洗滌3次, 將收集的藻細(xì)胞液氮速凍后, 冷凍干燥備用。總脂的提取及定量參照文獻(xiàn)[12]。稱取100 mg干藻粉加入一定體積的氯仿∶甲醇 (1∶2) 溶劑萃取充分, 然后加入一定比例的滅菌ddH2O促使分層, 離心收集下層的氯仿層,轉(zhuǎn)入已稱重的稱量瓶中, N2吹干有機(jī)溶劑, 然后用分析天平稱重, 計(jì)算總脂的含量。

總脂甲酯化按如下步驟進(jìn)行: 將一定量的總脂轉(zhuǎn)移到1.5 mL Aglient 玻璃瓶中, 加入1 mL 1 mol/L的硫酸甲醇溶液, 充N2后密封, 于100℃反應(yīng)1h。冷卻后, 加入200 μL 蒸餾水, 混勻后, 以200 μL正己烷萃取3次, 合并有機(jī)相, N2吹干后定容至100 μL, 取1 μL 用Ultra Trace 氣相色譜分析儀 (Thermo Scientific, United States)進(jìn)行脂肪酸組成分析。

2 結(jié)果與討論

對于戶外培養(yǎng), 特別是開放池培養(yǎng)而言, 培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)導(dǎo)致培養(yǎng)液的鹽度變化很大。因而, 在篩選具有應(yīng)用前景的藻株時(shí), 鹽度的耐受性是必須考慮的重要因素之一。盡管微擬球藻屬的種類多為海生, 但近年來的研究顯示在淡水中也有廣泛的分布[4], 而有些分離自河口的種類也能在淡水中生長。眼點(diǎn)微擬球藻盡管是海生類型,但在低鹽度(4‰)下仍然生長良好[17], 我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示, 盡管在淡水中該藻細(xì)胞的生長和葉綠素a含量要低于海水(P<0.01,t-test), 但仍然能夠維持生長(圖1)。本研究結(jié)果表明, 所有6株海生微擬球藻均能在淡水中生長, 從藻細(xì)胞葉綠素a含量看, 淡水培養(yǎng)的海生微擬球藻葉綠素的合成并沒有受到明顯抑制, 相反, 對于海洋微擬球藻PP983和加的斯微擬球藻而言, 淡水培養(yǎng)的藻細(xì)胞葉綠素相對含量超過(P<0.01,t-test)或接近(P>0.05,t-test)海水培養(yǎng)的藻細(xì)胞, 說明這兩種微擬球藻即使在淡水中也能維持最適的生長狀態(tài)。與此不同的是, 作為淡水的湖泊微擬球藻并不能夠在海水中生長。

除在低鹽度下生長良好外, 多數(shù)海生的微擬球藻還能耐受較高的海水鹽度, 如眼點(diǎn)微擬球藻、加的斯微擬球藻和海洋微擬球藻PP983可耐受的最高鹽度分別為: 54‰、42‰和54‰[10,17,18]。Lubián[19]的研究也顯示加的斯微擬球藻、鹽生微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻具有較廣的鹽度耐受范圍。由此可見, 除湖泊微擬球藻外, 微擬球藻屬的海生種類對鹽度變化均有較高的耐受性, 適于在戶外進(jìn)行開放式的培養(yǎng), 特別是加的斯微擬球藻由于在淡水和海水均能維持較適的生長, 顯示出較大的表型可塑性,因而, 具有良好的應(yīng)用前景。

圖 1 七株微擬球藻在f/2AW和BG11中培養(yǎng)7d后的A730值(A)及藻細(xì)胞相對葉綠素a含量(B)Fig.1 Growth (A730) and relative amount chlorophyll a of seven Nannochloropsis strains cultured for 7 day in f/2AW and BG11 medium

圖2 七株微擬球藻總脂的硅膠板薄層層析圖Fig.2 Comparison of lipid composition and content in Nannochloropsis species by thin layer chromatography

將7株微擬球藻在氮濃度相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期(氮源被消耗完后約3d), 收集藻細(xì)胞后提取總脂進(jìn)行薄層層析分析, 比較它們的中性脂含量及組成(圖2)。薄層層析結(jié)果顯示, 所有藻株均含有不同量的一酯、二酯和三酯, 其中甘油三酯的量最大。除海洋微擬球藻MBIC10090的甘油三酯量略低外, 其他6株微擬球藻細(xì)胞中含有的甘油三酯量相當(dāng)?？梢姀挠椭可峡? 這些微擬球藻均可作為生產(chǎn)生物柴油的原料。與我們的研究不同, 李秀波等[20]在淡水微擬球藻中僅檢測到了很低的甘油三酯含量, 這與他們所使用的BG11培養(yǎng)基具有較高的氮濃度有關(guān), 因?yàn)橥瑫r(shí)收獲低(882 μmol/L)和高(17.6 mmol/L)兩種氮濃度下培養(yǎng)的海水和淡水微擬球藻會導(dǎo)致淡水微擬球藻的生長仍然處于氮豐富條件。

為了解批量培養(yǎng)條件下微擬球藻油脂積累的規(guī)律,我們以加的斯微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻為對象, 通過尼羅紅染色熒光分光光度法測定了藻細(xì)胞中的中性脂含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化及其與培養(yǎng)基中氮濃度的關(guān)系(圖3)。結(jié)果顯示, 在培養(yǎng)的第6天, 培養(yǎng)液中的NO3?基本被消耗殆盡, 而藻細(xì)胞中的中性脂則在培養(yǎng)的第7天開始增加, 加的斯微擬球藻在缺氮后2d, 細(xì)胞的中性脂有明顯增加的趨勢, 且增加的幅度明顯高于眼點(diǎn)微擬球藻。從生長上看, 2個(gè)藻株的比生長速率相當(dāng), 但加的斯微擬球藻的生物量要大于眼點(diǎn)微擬球藻。

許多研究表明, 對數(shù)生長后期藻細(xì)胞可開始積累油脂, 至穩(wěn)定期積累的油脂可達(dá)到最大值[7,21]。盡管加的斯微擬球藻細(xì)胞中與甘油三酯合成相關(guān)的基因具有組成型表達(dá)的特性[10], 但我們的結(jié)果顯示, 缺氮仍然可以顯著促進(jìn)藻細(xì)胞中性脂的積累, 這可能是氮缺乏導(dǎo)致其他代謝路徑的改變, 從而促進(jìn)了細(xì)胞脂質(zhì)的合成。

將培養(yǎng)10d的加的斯微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻收獲用于分析藻細(xì)胞的總脂含量及其脂肪酸組成。表1顯示兩種微擬球藻的總脂含量均超過50%, 其脂肪酸組成以C16:0和C16:1為主, 兩者之和占總脂肪酸的70%左右。此外, C14:0和C18:1兩種脂肪酸約占15%—17%; 微擬球藻屬中最主要的多不飽和脂肪酸EPA在兩種藻中的含量約為8%—10%, 較低的EPA含量與培養(yǎng)基中的氮濃度和收獲期有關(guān), 氮限制或穩(wěn)定期收獲均導(dǎo)致多不飽和脂肪酸含量下降[22]。我們的結(jié)果顯示, 盡管微擬球藻具有較高的多不飽和脂肪酸, 但在培養(yǎng)液缺氮數(shù)天后收獲藻細(xì)胞,最終使得加的斯微擬球藻多不飽和脂肪酸含量不超過12%, 符合作為生物柴油原料的歐洲標(biāo)準(zhǔn)。

圖 3 不同生長時(shí)期所對應(yīng)的兩種微擬球藻的細(xì)胞密度(A)、培養(yǎng)液NO3?濃度與尼羅紅染色熒光強(qiáng)度(B)Fig.3 Cell density (A), NO3?concentrations in medium and oil content (B) of Nannochloropsis sp.cultured at different growth phase NOc.N.oculata; NGa.N.gaditana

表1 加的斯微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻的脂肪酸組成及其總脂含量(占藻細(xì)胞干重)Tab.1 Fatty acid composition (mol %) and total lipid content (% dry cell weight) of Nannochloropsis gaditana and N.oculata

本研究通過比較產(chǎn)油的7株微擬球藻對鹽度的耐受及其油脂積累的規(guī)律, 綜合多方面的特性, 發(fā)現(xiàn)加的斯微擬球藻具有較廣的鹽度耐受范圍、高的生物量、高的中性脂含量、缺氮后油脂快速積累的能力及合適的脂肪酸組成, 因而, 是一種有應(yīng)用前景的產(chǎn)油微藻, 在戶外進(jìn)行開放式培養(yǎng), 可望成為低廉的微藻生物柴油原料。

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STUDY ON THE SALINITY TOLERANCE AND OIL ACCUMULATION IN NANNOCHLOROPSIS

HUANG Wei-Chao1,2and HU Han-Hua1
(1.Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

微擬球藻; 三酰基甘油; 生物柴油; 鹽度耐受

Nannochloropsis; Triacylglycerols; Biodiesel; Salinity Tolerance

Q949.2

A

1000-3207(2013)02-0383-05

10.7541/2013.31

2012-03-21;

2012-12-07

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB200901)資助

黃偉超(1986—), 女, 河北石家莊人; 碩士研究生; 主要從事藻類生物技術(shù)研究。E-mail: huangweichao88@126.com

胡晗華, E-mail: hanhuahu@ihb.ac.cn