楊移斌 夏永濤 鄭衛(wèi)東 胡 鯤 楊先樂

(1. 上海海洋大學國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院, 北京 100039;3. 中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223)

西伯利亞鱘隸屬于硬骨魚綱, 輔鰭亞綱, 硬鱗總目,鱘形目(Acipenseriformes), 全世界現(xiàn)存 26種鱘[1], 我國的鱘類有2科3屬8種, 分布在長江水系的有中華鱘(Acipenser sinensis)、白鱘(Psephurus gladius)和達氏鱘(Acipenser dabryanus); 黑龍江水系的有施氏鱘(Acipenser schrenckii)和達氏鰉(Huso dauricus); 新疆地區(qū)有裸腹鱘(Acipenser nudiventris)、小體鱘(Acipenser ruthenus)和西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[2]。鱘魚是地球上最古老的魚種之一,素有“活化石”之稱, 是我國的名特優(yōu)珍品, 肉味鮮美、骨軟、營養(yǎng)價值高, 鱘魚肉和卵的蛋白含量高達18%和29%。另外特別值得一提的是具有“黑色黃金”之稱的鱘魚子醬, 是由鱘魚卵加工而成, 更是馳名中外的高檔食品, 在國際市場十分走俏。我國第一個鱘魚養(yǎng)殖場1992年在大連瓦房店成立, 開啟了我國鱘魚的商業(yè)化養(yǎng)殖, 西伯利亞鱘養(yǎng)殖規(guī)模居中國鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的第 1位[2], 但隨著養(yǎng)殖品種及規(guī)模的不斷增加, 病害正在逐步增加, 已經(jīng)嚴重影響了鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。如革蘭氏陰性菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas carvia)和類志賀鄰單胞菌(Plesimonas shigelloides)[3—6]感染鱘魚致病的報道, 還有革蘭氏陽性菌鏈球菌感染鱘魚使其致病[7,8]的報道。2012年6月我國浙江省衢州市鱘魚養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的鱘魚出現(xiàn)生殖孔紅腫,有膿狀物流出, 病魚解剖觀察發(fā)現(xiàn)性腺從生殖孔處開始布有小斑點, 呈紫紅色, 性腺呈糜爛狀并最后與體壁脫離, 心臟出現(xiàn)嚷腫, 肝臟顏色呈灰色, 體壁未充血, 也未出血, 脾臟嚴重充血導致呈紫黑色, 腸內無食物, 腎臟未充血, 但是發(fā)生病變。發(fā)病鱘魚集中在西伯利亞鱘、史氏鱘和雜交鱘。本研究從發(fā)病鱘魚中分離出一株高致病性的致病菌, 通過常規(guī)生理生化鑒、16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對該菌進行了分類鑒定, 并測定了其一些生物學特性和對藥物敏感性, 旨在為鱘魚魯氏耶爾森氏菌病的有效防控提供理論參考依據(jù), 且為鱘魚健康養(yǎng)殖及病害防治增加新的內容。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗用魚 試驗用魚為易感染發(fā)病的西伯利亞鱘,病魚采自浙江衢州鱘魚養(yǎng)殖場, 人工感染用健康西伯利亞鱘取自此養(yǎng)殖基地。

主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、5%綿羊血平板和水解酪蛋白瓊脂(MH)按常規(guī)方法自制; 腦心浸出液瓊脂購自北京陸橋生物制品有限公司; 細菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增細菌16S rDNA試劑盒, TaqDNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術服務有限公司; 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

流行病學調查及發(fā)病癥狀觀察 調查養(yǎng)殖場鱘魚發(fā)病情況及死亡率, 了解發(fā)病種類及規(guī)格以及掌握相應水域環(huán)境狀況。查看魚體外表, 解剖觀察內臟器官是否有明顯的病變, 從而確定疾病的基本癥狀, 并取病樣組織進行病原菌分離與純化。

病原菌分離純化 選取具有典型癥狀的西伯利亞鱘, 用75%的酒精在病魚體表消毒后, 解剖開取其性腺、肝、腎等病灶組織少許, 無菌條件下劃線接種于腦心浸出液瓊脂和營養(yǎng)瓊脂平板上, 置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—48h, 挑起在平板上較多的、形態(tài)顏色一致的菌落,選擇單個菌落進一步劃線培養(yǎng)純化, 最后轉移到營養(yǎng)瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上, 于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人工感染試驗 選取健康的西伯利亞鱘, 設 1個實驗組和1個對照組。試驗組為6尾, 對照組為4尾, 水溫都控制在 20—22℃, 模擬自然發(fā)病環(huán)境狀況。細菌HD0923在營養(yǎng)瓊脂上28℃培養(yǎng)24h, 用無菌生理鹽水洗下菌苔, 用麥氏比濁法測定并調節(jié)菌懸液濃度為 4×107CFU/mL, 分別對實驗組鱘魚進行胸鰭基部注射, 每尾注射0.2 mL菌液。對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水, 試驗水缸連續(xù)充氧, 不投喂。觀察魚的發(fā)病及死亡情況, 并對瀕死魚及時剖檢和對致病菌的再次分離與純化。

病原菌形態(tài)與理化特性檢測 將菌株 HD0923接種普通營養(yǎng)瓊脂平板, 28℃培養(yǎng)24h后觀察菌落的大小、形態(tài)及顏色, 同時革蘭氏染色, 采用光學顯微鏡觀察細菌其形態(tài), 其他各項生理生化指標的測定參照文獻[9]進行。

菌株 HD0923的 16S rDNA基因序列測定與分析(1)細菌 16S rDNA模板的制備: 將細菌接種于腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI)中, 28℃震蕩培養(yǎng)18h, 12000 r/min離心收集菌體, 按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA, 作為PCR的模板DNA。

(2)16S rDNA基因系列的擴增與測序: 用于 16S rDNA的 PCR反應的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

正向引物為 27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′(對應于 E. coli的 16S rRNA 基因的第 8—27 bp 位置)。

反向引物 1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(對應于E. coli的16S rRNA基因的第1492—1510 bp位置)。

PCR反應條件為: 95℃變性3min, 94℃平衡35s, 55℃退火 35s, 72℃延伸 1min, 此階段 35個循環(huán), 72℃溫育10min。經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測以證明 PCR擴增得到的片段是否是目的片段后,將PCR的最終產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化和序列測定。

(3)構建系統(tǒng)發(fā)育樹: 將菌株HD0923的16S rDNA序列用運用NCBI數(shù)據(jù)庫中細菌的16S rDNA進行比對, 從中選取17株與該株菌基因序列最相似的菌株和5種水產(chǎn)常見病原菌, 采用 Clustal w軟件進行多序列匹配分析,用MEGA5.1軟件包中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹, 通過1000次Bootstrap檢驗置信度。

藥物敏感試驗 藥敏試驗采用 K-B法, 將菌株HD0923接種于腦心浸出液(BHI)液體培養(yǎng)基, 置于 28℃搖床培養(yǎng) 18h后分別涂布水解酪蛋白瓊脂(MH)平板。選擇 17種藥敏紙片均勻貼于平板, 每個平板貼 5片, 置28℃下培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑。根據(jù)《現(xiàn)代診斷學手冊》[10]標準判定細菌對藥物的敏感性。

2 結果

2.1 自然發(fā)病流行情況及臨床表現(xiàn)

2012年6月中旬至8月浙江衢州衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開發(fā)有限公司的花園基地接連不斷出現(xiàn) 3齡以上的以西伯利亞鱘、史氏鱘、雜交鱘為主的死亡現(xiàn)象, 本公司其他幾個相鄰鱘魚養(yǎng)殖基地相繼發(fā)生, 死亡率高達80%。發(fā)病水溫在 20—22℃。發(fā)病初期病魚緩慢游動, 精神不振, 表現(xiàn)為鄰近水面離群獨游或者靜止不動, 嚴重者身體失去平衡、貼壁側游或尾巴向上、頭向下漂浮在水中,食欲漸減至不食, 生殖孔出現(xiàn)紅腫潰爛。檢查鱘魚性腺成熟度時, 能發(fā)現(xiàn)鱘魚生殖孔出現(xiàn)輕微紅點, 即開始發(fā)病。發(fā)病鱘魚的主要癥狀初期體表表現(xiàn)為有絕大多數(shù)發(fā)病鱘魚下頜有潰爛產(chǎn)生, 尤以生殖孔部位出血潰爛明顯。解剖觀察發(fā)現(xiàn)內臟器官存在不同程度的損傷, 體壁未充血,肝臟呈灰色且腫大、易碎, 脾臟出血嚴重導致呈紫黑色,腎臟呈紫紅色, 心臟呈嚷腫狀。潰爛部位集中在性腺, 潰爛前表面形成紫紅色出血點, 深度大約 3 cm左右, 有的布滿整個性腺, 有的只在靠近生殖孔一端發(fā)現(xiàn), 有的從靠近生殖孔一端開始潰爛, 有的是整個性腺一起潰爛,性腺潰爛成膿血水, 從生殖孔流出體外, 性腺從體壁脫落, 最終發(fā)病鱘魚死亡。

2.2 病原菌分離

從 5尾具有典型發(fā)病癥狀但未死亡的病魚肝臟、腎臟和性腺組織取樣于營養(yǎng)瓊脂和腦心浸出液瓊脂平板上劃線, 置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h后獲得一株優(yōu)勢細菌, 編號為 HD0923。該菌在營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好,形成橢圓形, 表面光滑, 邊緣整齊, 整個菌落呈凸起狀,直徑1 mm的透明的白色菌落。從人工感染的病魚取同樣的組織劃線分離, 得到的菌株菌落形態(tài)、大小、顏色與此一致。

2.3 人工感染試驗

試驗組西伯利亞鱘在接種感染后 24h, 表現(xiàn)為無力游動, 呼吸緩慢, 生殖孔紅腫, 有橙色膿狀液體從生殖孔流出, 發(fā)病鱘占試驗組鱘總數(shù) 66.7%, 而對照組未見異常。對發(fā)病的西伯利亞鱘進行觀察發(fā)現(xiàn)生殖孔紅腫潰爛,解剖可見肝臟呈灰色, 脾臟嚴重出血呈紫黑色, 腎臟呈紫紅色, 心臟呈嚷腫狀, 性腺表面有紫紅色出血點, 性腺出現(xiàn)潰爛, 從靠近生殖孔處開始潰爛, 性腺潰爛成膿血水, 從生殖孔流出體外, 與自然發(fā)病鱘魚和病變相似。并從感染死亡魚肝臟、腎臟和性腺組織分離到與菌株HD0923形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列分析一致的細菌, 表明菌株HD0923是鱘魚此病的病原菌。

2.4 形態(tài)特征

分離菌株 HD0923為革蘭氏陰性短狀桿菌, 無芽孢和莢膜, 在普通營養(yǎng)瓊脂菌落呈灰白色, 橢圓形, 表面光滑, 邊緣整齊的白色菌落, 整個菌落呈凸起狀, 直徑 0.7—1 mm; 在腦心浸出液瓊脂平板上形成橢圓形, 表面光滑, 邊緣整齊, 整個菌落呈凸起狀, 直徑1—1.3 mm的透明的白色菌落; 在5%綿羊血平板上不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.5 生理生化特征

分離菌株 HD0923適宜生長溫度范圍為 18—36℃,最適生長溫度為 24—31℃, 其中在 28—29℃有一個生長的明顯加快階段。其適宜生長的 pH范圍為 4—10, 最適pH為5.0—8.0, 其他的生理生化特征(表1)。

2.6 16S rDNA的PCR擴增結果及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴增分離株HD0923獲得的16S rDNA基因片段約1500 bp (圖1)。測序獲得長1416 bp的片段, 獲得的序列與GenBank中已收錄的相關性較高的16S rDNA序列進行比對分析結果表明, 從發(fā)病西伯利亞鱘分離的細菌16S rDNA基因序列與魯氏耶爾森氏(Y. ruckeri)同源性最高, 為 100%, 選取了檢索的部分耶爾森氏菌屬細菌和水產(chǎn)上常見病原菌的 16S rDNA基因序列用 Neighbor-Joining方法進行系統(tǒng)發(fā)育學分析, 其系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。在系統(tǒng)發(fā)育樹上HD0923株與魯氏耶爾森氏菌(Y. ruckeri)聚為一個分支, 同源性達到 100%。根據(jù)分離菌的形態(tài)特征及理化特性, 結合16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析結果, 判定該菌為魯氏耶爾森氏菌(Y. ruckeri)。

表1 HD0923菌株的生理生化特征Tab. 1 Physiological and biochemical characteristics of HD0923

2.7 藥敏試驗結果

分離株 HD0923對 17種藥物的敏感性結果(表 2)表明, 分離菌株HD0923對強力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、先鋒霉素V、阿莫西林、阿奇霉素、左氧氟沙星、痢特靈、慶大霉素 10種藥物高度敏感, 對青霉素和克林霉素不敏感, 對其他幾種藥物中度敏感。

3 討論

目前國內關于鱘魚細菌性病害的報道呈不斷增加的趨勢, 如楊治國、儲衛(wèi)華、曹海鵬等先后對西伯利亞鱘相關疾病進行了報道, 主要病原為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)以及類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[3—6], 潘厚軍等對西伯利亞鱘感染停乳鏈球菌[8]的報道, 使得鱘魚健康養(yǎng)殖受到巨大的威脅, 西伯利亞鱘細菌性疾病成為了其養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸之一。

圖1 分離菌株HD0923的16S rDNA的PCR擴增結果Fig.1 The result of 16SrDNA PCR amplification of HD0923 strain

圖2 根據(jù)16S rDNA基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence homolog

本研究從發(fā)病西伯利亞鱘的肝臟、腎臟和性腺均分離到一株革蘭氏陰性細菌 HD0923, 發(fā)現(xiàn)其對鱘具有明顯的致病性, 經(jīng)人工感染后出現(xiàn)生殖孔紅腫潰爛, 解剖發(fā)現(xiàn)各器官不同程度損傷, 性腺發(fā)生潰爛; 與自然發(fā)病的癥狀一致, 而在人工感染發(fā)病鱘魚肝臟、腎臟和性腺也分離到與HD0923形態(tài)特征、理化特性一致的菌株, 表明菌株 HD0923是西伯利亞鱘的該病的致病菌。菌株HD0923經(jīng)過形態(tài)學和生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析證實該菌株為魯氏耶爾森氏菌(Y.ruckeri)。

目前的細菌分類鑒定法, 主要包括表型鑒定和分子遺傳學鑒定兩大類[11]。細菌的常規(guī)鑒定法—形態(tài)法是經(jīng)典、常用的分類鑒定方法, 其結果準確, 但鑒定耗時較長。依據(jù)細菌生理生化特性進行分類的方法, 通常由于生化的不完全性, 反應過度, 結果判斷誤差等造成鑒定不準, 以及從不同的水域和寄主體內分離到的菌株由于水域、氣候、水質等方面的不同而產(chǎn)生細小的生化特性差異,一般情況下只能準確鑒定到屬。在本研究中因阿拉伯糖等生化特性方面與標準菌株不同, 也與汪開毓等在斑點叉尾體內分離到的魯氏耶爾森氏菌不同[12], 隨著科學技術的發(fā)展, 特別是分子生物學取得突破性進展, 細菌的鑒定也進入到分子生物學水平, 多種基因型分類方法也應運而生了, 如 DNA雜交、rDNA指紋圖、質粒圖譜、(G+C) mol%、16S rDNA序列分析及Gyrb序列分析等。16S rDNA序列分析成為細菌種屬鑒定和分類的常用標準方法, 并于廣泛應用于水產(chǎn)動物疾病病原菌的種屬鑒定[13,14]。主要步驟是把測出來的細菌16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對, 從而構建其系統(tǒng)發(fā)育樹,確定細菌種類。本研究通過 16S rDNA序列同源性分析,構建了系統(tǒng)發(fā)育樹, 結果發(fā)現(xiàn)分離到的菌株HD0923為與魯氏耶爾森氏菌的同源性達到 100%, 結合形態(tài)學和生理生化鑒定結果, 從而確定該致病菌HD0923為魯氏耶爾森氏菌。

魯氏耶爾森氏菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、耶爾森氏菌屬(Yersinia), 是冷水性鮭科魚類的常見紅嘴病病原菌[15], 現(xiàn)在幾乎對養(yǎng)殖的鮭鱒魚類品種都具感染性, 并且該菌亦被發(fā)現(xiàn)能引起溫水性鯉科鰱、鳙魚的發(fā)病和死亡[16], 危害較大。該菌自1952首次從美國暴發(fā)的紅嘴病中分離到后[15], 現(xiàn)流行于澳大利亞、南非和西歐等地,宿主范圍和地域都進一步擴大, 表明該菌具有廣泛的致病性。但是在人工養(yǎng)殖的鱘魚體內引起性出血潰爛在國內尚屬首次, 筆者推測可能原因是鱘魚亦屬冷水性魚類,在生活習性上與鮭科魚類具有一定的相關性。而且此次西伯利亞鱘自然感染魯氏耶爾森氏菌發(fā)病的水溫在 20—22℃左右, 出現(xiàn)的臨床癥狀與文獻報道的感染魯氏耶爾森氏菌后發(fā)病魚的臨床癥狀相似[17,18], 發(fā)病水溫相近,特別與汪開毓等報道斑點叉尾感染魯氏耶爾森氏菌導致肛門紅腫, 下頜出血, 脾臟嚴重出血呈紫黑色, 性腺有不同程度的出血等癥狀相似[12]。不同的是本次發(fā)病鱘魚的性腺發(fā)生嚴重潰爛, 死亡率高, 鱘充血體內各實質器官充血不如其他報道魚類明顯。另據(jù)文獻資料表明當水溫低于 20℃時, 魯氏耶爾森氏菌分泌的致病性外毒素溶血素的能力增強使細菌的毒力增大, 但在最適生長溫度28℃時, 魯氏耶爾森氏菌分泌的致病性毒素溶血素的活性并不強[19]。在本研究中在5%綿羊血平板上生長的魯氏耶爾森氏菌未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象, 與汪開毓等結果相同[12]。據(jù)本研究觀察發(fā)現(xiàn)此次發(fā)布鱘魚性腺產(chǎn)生嚴重潰爛, 這與鮭鱒魚類、溫水性鰱鳙以及斑點叉尾感染魯氏耶爾森氏菌的癥狀明顯不同, 可能是由于不同水域條件、發(fā)病物種以及不同氣候環(huán)境導致的, 需進一步探究。

表2 HD0923藥敏試驗結果Tab.2 Antibiotic sensitivity test of strain HD0923

本研究結果表明, 魯氏耶爾森氏菌 HD0923對強力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、先鋒霉素V、阿莫西林、阿奇霉素、左氧氟沙星、痢特靈、慶大霉素10種藥物高度敏感, 但對青霉素和克林霉素不敏感, 表現(xiàn)很強的耐藥性。這與汪開毓等從感染魯氏耶爾森氏菌的斑點叉尾體內分離到的魯氏耶爾森氏菌藥敏特性有所不同[12], 與其結果對比氯霉素的敏感性下降, 產(chǎn)生藥敏特性差異的可能原因是不同區(qū)域、不同水域環(huán)境中的菌株接觸到不同的藥物環(huán)境作用影響而產(chǎn)生耐藥性變異的差異[20]。此外, 本研究選取的藥物并非均可用于生產(chǎn), 在本研究中僅用于分析魯氏耶爾森氏菌 HD0923的藥敏特性,魯氏耶爾森氏菌HD0923的藥敏實驗結果表明, 在生產(chǎn)中治療感染魯氏耶爾森氏菌的病魚時可選那些高度敏藥物進行防治, 氟苯尼考來是個不錯的選擇。但是魯氏耶爾森氏菌 HD0923對一些水產(chǎn)常用抗生素已產(chǎn)生極強的耐藥性, 這是個危險的信號, 暗示我們鱘魚養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中要慎重選用漁用抗生素, 盡量防止細菌產(chǎn)生耐藥性。雖然現(xiàn)在的化學藥物是防治水產(chǎn)動物疾病防治的主要手段, 但是長期使用化學藥品特別是抗生素等將導致病原產(chǎn)生耐藥性, 結果是疾病防治失敗, 同時也很有可能導致水產(chǎn)品中的藥物殘留問題, 影響水產(chǎn)品質量和安全等。自從魯氏耶爾森氏菌的福爾馬林滅活疫苗首次在鮭科魚類疾病防治中使用以來[21], 注射疫苗法都是預防魚類魯氏耶爾森氏菌病發(fā)生的重要方法[22]。但由于魯氏耶爾森氏菌是在鱘魚體內被發(fā)現(xiàn)的報道不多, 相關的研究亦不多, 注射疫苗防治法研究的開展更少, 因此在探索疫苗免疫防治的同時不妨進行生態(tài)防治, 利用微生物制劑無殘留以及對水質影響不大的優(yōu)點進行防治, 降低養(yǎng)殖生產(chǎn)的損失。