孫江彥，楊國(guó)龍，畢艷蘭，陳素琴，孫尚德，梁少華

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

近些年，功能性與營(yíng)養(yǎng)性油脂的需求越來(lái)越大[1]，因此以更經(jīng)濟(jì)、更環(huán)保的方法制取這些油脂成為一個(gè)值得研究的課題.由于酶促反應(yīng)具有特定專(zhuān)一性、低溫、高酶活性等優(yōu)點(diǎn)，酶促酯交換的研究顯得越來(lái)越重要.提高脂肪酶的活性、穩(wěn)定性與溶解性一直是研究的熱點(diǎn)，采用的方式主要有聚乙二醇修飾法、脂肪酸共價(jià)偶聯(lián)法、陰離子交換樹(shù)脂固定法[2-5]，但由于各種原因，這些方法得到的酶的酶促反應(yīng)速率小，由于水的存在還會(huì)產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，如甘油二酯、甘油一酯.最近有研究利用非離子表面活性劑修飾脂肪酶，其研究的是脂肪酶和非離子表面活性劑的混合物，混合物中非離子表面活性劑的親水基團(tuán)連在脂肪酶表面，疏水基團(tuán)排列在脂肪酶外邊，這種排列使修飾酶在有機(jī)溶劑中具有更好的溶解性、更高的反應(yīng)活性，同時(shí)能減少副反應(yīng)[6-11].

筆者采用蔗糖酯修飾豬胰脂酶，利用酶催化茶油與軟脂酸反應(yīng)的酯交換量為考察指標(biāo)，探討蔗糖酯添加量、醇水比和攪拌時(shí)間對(duì)修飾酶活性的影響，同時(shí)研究了修飾酶與未修飾酶的熱穩(wěn)定性，為非離子表面活性劑修飾酶的研究提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬胰脂酶：丹麥諾維信公司；茶油：河南信陽(yáng)長(zhǎng)園野生茶油有限公司；棕櫚酸（純度≥98%）：Sigma公司；蔗糖酯：三菱化學(xué)食品株式會(huì)社；正己烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；無(wú)水乙醚、甲酸等均為分析純.

Agilent6890N 氣相色譜儀：美國(guó)Agilent 公司；BPX-70 色譜柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm）：澳大利亞SGE 公司；DF-101C 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；BS201s 電子天平；ZF-I 型三用紫外分析儀；薄層板（20 cm×20 cm）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酶的修飾

取一定量的蔗糖酯加入無(wú)水乙醇中，在40 ℃下攪拌（600 r/min），緩慢加入適量蒸餾水，攪拌至蔗糖酯完全溶解，而后向蔗糖酯/乙醇水溶液中加入豬胰脂酶，在恒溫條件下攪拌一定時(shí)間后，混合物離心分離，冷凍干燥后得到修飾酶.

1.2.2 修飾前后脂肪酶促酯交換反應(yīng)的催化活性測(cè)定

稱(chēng)取2 g 茶油置于50 mL 燒瓶中，加入20 mL異辛烷和軟脂酸（n（軟脂酸）∶n（茶油）=2∶1），混合體系與脂肪酶（ω（茶油）=15%）一起置于密閉環(huán)境下靜置48 h，以飽和碳酸鉀溶液控制反應(yīng)體系的水活度（αW=0.43）；然后將酶加到反應(yīng)體系中，40℃下反應(yīng)4 h；分離混合物中的甘三酯，用氣相色譜儀分析其脂肪酸組成；以4 h 后的酯交換量來(lái)評(píng)價(jià)脂肪酶修飾前后的催化活性.

酶的催化活性=產(chǎn)物甘三酯中軟脂酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)－原料茶油中軟脂酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù).

1.2.3 酯交換產(chǎn)物中甘三酯的組成分析

取1 mL 反應(yīng)產(chǎn)物置于離心管中，離心分離后吸取上層0.5 mL，點(diǎn)在20 cm×20 cm 的薄層板上，用展開(kāi)劑（石油醚∶乙醚∶甲酸=70∶30∶1）展開(kāi)，在距離頂端1.5 cm 時(shí)取出薄層板，在通風(fēng)櫥中晾干，均勻噴上2，7-二氯熒光素顯色，在紫外分析儀上觀察并刮下甘三酯的譜帶，簡(jiǎn)易堿式甲酯化后用氣相色譜分析脂肪酸組成.

1.2.4 甘三酯簡(jiǎn)易堿式甲酯化方法

從薄層板上刮下甘三酯的譜帶（甘三酯與硅膠的混合物）溶于2.5 mL 正己烷中，再加入1 mL 0.5 mol/L 的甲醇鈉溶液，混合后室溫下輕搖5 min，加入適量無(wú)水硫酸鈉，靜置1 h 后，于2 000～3 000 r/min 下離心2 min，吸取上清液用于氣相色譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖酯添加量對(duì)修飾酶活性的影響

在30 ℃，醇水比1∶3，攪拌時(shí)間40 min的條件下，考察6 種蔗糖酯（S-370、S-570、S-770、S-970、S-1170、S-1670）的添加量對(duì)修飾酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 蔗糖酯添加量對(duì)修飾酶活性的影響

由圖1 可知，隨著添加量的增加，6 種蔗糖酯修飾的豬胰脂酶催化酯交換的酯交換量的變化規(guī)律大致相同，均先增大后減小，但變化的大小程度不同.S-370、S-570、S-1670 的添加量在5%時(shí)，其修飾的豬胰脂酶催化酯交換的酯交換量達(dá)到最大，接著開(kāi)始下降.S-770 的添加量在15%時(shí)，修飾酶催化酯交換的酯交換量達(dá)到最大，接著顯著變小.S-1170 的添加量在2%～15%時(shí)，修飾酶催化酯交換的酯交換量緩慢增加，在添加量達(dá)到15%時(shí)達(dá)到最大，然后緩慢降低.S-970 的添加量在20%時(shí)，修飾酶催化酯交換的酯交換量顯著增大達(dá)到最大，接著明顯減小.

Thakar 等[12]研究表明，表面活性劑的種類(lèi)和用量對(duì)修飾酶催化酯交換反應(yīng)有重要的影響，陰離子型表面活性劑會(huì)抑制修飾酶活力，陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑會(huì)促進(jìn)酶活力的發(fā)揮，非離子型表面活性劑修飾效果比陽(yáng)離子型的效果好，較低的表面活性劑用量能顯著提高修飾酶的活性.乙醇溶液體系中Span 修飾豬胰脂酶的研究結(jié)果表明，Span 用量在20%～25%時(shí)，修飾酶具有較高的催化活性[13].乙醇溶液體系中Tween 修飾豬胰脂酶的研究結(jié)果顯示，Tween 用量為5%～20%時(shí)修飾酶具有較好的催化活性[14].

2.2 醇水比對(duì)修飾酶活性的影響

在30 ℃，蔗糖酯添加量分別為S-370、S-570和S-1670 為5%，S-770 和S-1170 為15%，S-970為20%，攪拌時(shí)間為40 min 的條件下，考察醇水比對(duì)修飾酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 醇水比對(duì)修飾酶活性的影響

由圖2 可見(jiàn)，隨著醇水比的增加，酯交換量均是先增加后減少，但酯交換量的變化趨勢(shì)與蔗糖酯的種類(lèi)有關(guān).S-370、S-770、S-970、S-1170、S-1670 均在醇水比為1∶3 時(shí)，修飾酶催化酯交換的酯交換量達(dá)到最大；S-570 在醇水比為1∶2 時(shí)，修飾酶催化酯交換的酯交換量達(dá)到最大.

Kamiya 等[15]采用表面活性劑在緩沖溶液/乙醇混合體系中修飾脂肪酶，結(jié)果表明混合體系可以提高表面活性劑的分散性，還可以改變酶的溶解性，當(dāng)乙醇體積占總體積的0～20%時(shí)，修飾酶活性略有提高.曾俊等[13]的研究結(jié)果表明，乙醇占溶液總體積的20%～50%時(shí)，修飾豬胰脂酶具有較高的催化活性.張潔等[14]研究乙醇溶液體系中Tweens 修飾豬胰脂酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙醇與水的比例在1∶2～1∶3 間時(shí)，修飾酶的催化活性較高.

2.3 攪拌時(shí)間對(duì)修飾酶活性的影響

在30 ℃，蔗糖酯添加量分別為S-370、S-570和S-1670 為5%，S-770 和S-1170 為15%，S-970為20%，S-370、S-770、S-970、S-1170 和S-1670的醇水比為1∶3，S-570 的醇水比為1∶2 的條件下，考察攪拌時(shí)間對(duì)修飾酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 攪拌時(shí)間對(duì)修飾酶活性的影響

由圖3 可見(jiàn)，隨著攪拌時(shí)間的增加，酯交換量均是先增加后減少.S-370 和S-970 修飾的豬胰脂酶的酯交換量隨攪拌時(shí)間變化不大，攪拌時(shí)間為40 min 時(shí)酯交換量達(dá)到最大.S-570、S-770、S-1170 和S-1670 修飾的豬胰脂酶的酯交換量受攪拌時(shí)間的影響較大，攪拌時(shí)間為40 min 時(shí)，酯交換量達(dá)到最大，遠(yuǎn)高于其他攪拌時(shí)間下的酯交換量.乙醇溶液中Span 和Tweens 修飾豬胰脂酶時(shí)，攪拌30 min 均可完成修飾[13-14].

2.4 修飾酶的熱穩(wěn)定性

在30℃，蔗糖酯添加量分別為S-370、S-570和S-1670 為5%，S-770 和S-1170 為15%，S-970為20%，S-370、S-770、S-970、S-1170 和S-1670的醇水比為1∶3，S-570 的醇水比為1∶2，攪拌時(shí)間40 min 的條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)修飾酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 溫度對(duì)修飾酶活性的影響

由圖4 可知，在40～80 ℃的反應(yīng)條件下，6 種修飾酶的催化活性均高于未修飾酶，修飾酶在30℃下催化活性幾乎為零，在50～70℃催化活性分別達(dá)到最大，而未修飾酶的催化活性在60 ℃達(dá)到最大.80 ℃時(shí)酶催化活性急劇下降，可能是高溫導(dǎo)致酶失活的原因.蔗糖酯修飾的豬胰脂酶在40～80℃間催化反應(yīng)活性都高于未修飾酶，在50～70 ℃間，修飾酶均有較好的催化活性.

3 結(jié)論

在醇溶液體系下采用蔗糖酯修飾豬胰脂酶，研究不同修飾條件對(duì)修飾酶活性的影響.研究發(fā)現(xiàn)：在30 ℃下40 min 即可完成蔗糖酯對(duì)豬胰脂酶的修飾，但各種蔗糖酯修飾的最佳條件并不相同.S-370 修飾的最佳條件是添加量5%，醇水比1∶3；S-570 修飾的最佳條件是添加量5%，醇水比1∶2；S-770 修飾的最優(yōu)條件是添加量15%，醇水比1∶3；S-970 修飾的最優(yōu)條件是添加量20%，醇水比1∶3；S-1170 修飾的最優(yōu)條件是添加量15%，醇水比1∶3；S-1670 修飾的最優(yōu)條件是添加量5%，醇水比1∶3.熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，6 種蔗糖酯修飾的豬胰脂酶在40～80 ℃催化反應(yīng)活性都高于未修飾酶，在50～70℃，修飾酶均有較高的催化活性.

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