孔年紅

21世紀是基因工程技術蓬勃發(fā)展的時代，基因工程的興起是生物革命的必然結果，盡管基因工程的隱憂及爭論眾說紛紜，但其給人帶來的好處是顯而易見的。于是，作為熱點題，近幾年的高考題及一些模擬試卷中都有此類題型出現(xiàn)，且越考越細，難度也有所加大。下面筆者舉兩例談談此類題目的解析。

（1）①和②過程中所用的限制性內切酶分別是______、______。

（2）基因表達載體除了圖示組成外，至少還有______等（至少答兩個）。

（3）③過程中用酶切法可鑒定正、反義表達載體。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正義基因表達載體獲得0.05kb、3.25kb、5.95kb、9.45kb四種長度的DNA片段，則用NotⅠ酶切反義基因表達載體獲得DNA片段的長度應是______和______。

（4）④過程中利用農桿菌介導轉化棉花細胞的過程中，整合到棉花細胞染色體DNA的區(qū)段是______，轉化后的細胞再通過______形成植物體。

（5）導入細胞內的反義GhMnaA2 轉錄的mRNA能與細胞內的GhMnaA2轉錄的mRNA互補配對，從而抑制基因的表達，其意義是______。

【解析】這道題考查了基因工程的步驟、意義以及涉及的其它生物技術，比較具體?；虮磉_載體的構建是基因工程的核心，因此是本題的重點考查內容。構建目的基因的表達載體必須使目的基因和載體被限制性核酸內切酶同時酶切后露出相同的粘性末端。

（1）從圖中可以看出，纖維細胞E6啟動子兩側分別是限制酶HindⅢ和BamHⅠ的識別位點，所以①過程所用的限制性內切酶就是HindⅢ、BamHⅠ。同樣，目的基因GhMnaA2 兩側都是限制酶SmaⅠ的識別位點，所以②過程中所用的限制性內切酶就是SmaⅠ。

（2）基因表達載體的組成有復制原點、目的基因、啟動子、終止子和標記基因。

（3）如下圖，把用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正義基因表達載體獲得DNA片段長度標在左圖上，同樣在右圖上也可以標上相應的DNA片段長度，則用NotⅠ酶切反義基因表達載體獲得DNA片段的長度應是6.0kb和12.7kb。

（4）農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。所以④過程中利用農桿菌介導轉化棉花細胞的過程中，整合到棉花細胞染色體DNA的區(qū)段是（含有E6啟動子和GhMnaA2基因的）T-DNA。而轉化后的細胞形成植物體就是植物組織培養(yǎng)。

（5）導入細胞內的反義GhMnaA2 轉錄的mRNA能與細胞內的GhMnaA2 轉錄的mRNA互補配對，從而抑制基因的表達，就不能產(chǎn)生的β-甘露糖苷酶，就不能催化半纖維素降解，棉纖維長度也就不會變短。

請據(jù)圖回答下列有關問題：

（1）設計引物是cDNA（互補DNA）文庫構建過程的第一步，引物長度一般在15-30個堿基之間，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。若引物過短則存在______等問題。

（2）圖甲過程②、③分別需要在____、____酶的作用下形成cDNA 的第一條鏈、第二條鏈，這兩個過程都需要利用_____作為原料。

（3）在⑤和⑦過程中cDNA和質粒DNA的3'端都要各加上一段寡聚核苷酸（20個以下堿基的核苷酸短鏈），制成_____；過程⑧在DNA連接酶的作用下，形成重組DNA。圖示這種情況下能形成_____種重組DNA，理由是______。

（4）請根據(jù)圖乙電泳圖譜分析各限制酶的酶切位點，并在答題紙的質粒上標出各個限制酶的酶切位點和各位點間的大小。

【解析】這道題考查了構建基因文庫的過程及相關知識。

（1）設計引物是cDNA（互補DNA）文庫構建過程的第一步，引物長度一般在15-30個堿基之間，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。若引物過短會降低退火溫度影響引物與堿基配對，從而使非特異性增高。

（2）以mRNA為模板合成cDNA需要逆轉錄酶，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶作用合成雙鏈cDNA。合成cDNA需要的原料為4種游離的脫氧核苷酸。

（3）在⑤和⑦過程中cDNA和質粒DNA的3'端都要各加上一段寡聚核苷酸（20個以下堿基的核苷酸短鏈），制成黏性末端。同一種DNA的兩端的黏性末端是相同的，不存在自身環(huán)化或同種DNA兩兩結合的現(xiàn)象，所以只有目的基因正反兩種連接方式。

（4）根據(jù)圖乙電泳圖譜分析各限制酶的酶切位點判斷EcoRI的酶切位點在PstI和SalI之間。再畫圖，注意堿基對的多少比例。

答案：（1）沒有一定的特異性，容易導致錯配（或影響退火溫度）；（2）逆轉錄酶；DNA聚合酶；游離的脫氧核苷酸（3）黏性末端；1（或2）；同一種DNA的兩端的尾巴是相同的，不存在自身環(huán)化或同種DNA兩兩結合的現(xiàn)象。（4）如下圖（2分）。

此類題的解答主要是依據(jù)基因工程的操作步驟中每一步的知識點，抓住題目文字和圖示，必要時自己動手畫畫，多見識多練習，功到自然成。

（作者單位：江蘇省黃橋中學）