范麗麗，樊友軍，王珊珊，賴婷婷，武麗娜，沈星燦

(藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點實驗室，廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西桂林541004)

過氧化氫(H2O2)是生物體內(nèi)許多酶催化反應(yīng)的副產(chǎn)物，對其含量的準(zhǔn)確快速測定在工業(yè)、生物、臨床、環(huán)境和食品分析中具有重要意義。檢測H2O2的方法包括滴定法[1]、熒光光譜法[2]、分光光度法[3－4]、化學(xué)發(fā)光法[5]和電化學(xué)法[6－9]等。其中的辣根過氧化物酶電化學(xué)生物傳感器以其簡單、快速、靈敏、專一性強(qiáng)等特點而受到了人們的重視[10]。然而，酶電極中的酶受外界環(huán)境如溫度、濕度等的影響較大，不穩(wěn)定且易失活，直接影響著傳感器的壽命和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在一定程度上制約了酶電極的使用。因此，構(gòu)建性能優(yōu)越的無酶H2O2生物傳感器具有重要的現(xiàn)實意義。

導(dǎo)電聚合物由于具有優(yōu)良的導(dǎo)電性、較高的比表面積、易于制備和良好的生物相容性等特點近年來被廣泛用于電化學(xué)生物傳感器制備[11]。在眾多的導(dǎo)電聚合物中，聚－3，4－乙烯二氧噻吩(PEDOT)以其良好的環(huán)境穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可調(diào)等特點而備受關(guān)注[12－15]。石墨烯(Graphene)發(fā)現(xiàn)于 2004年[16]，其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)使其在電化學(xué)生物傳感研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9，17－20]。目前，已有多篇文獻(xiàn)報道了石墨烯和導(dǎo)電聚合物構(gòu)成的納米復(fù)合材料用于制備電化學(xué)生物傳感器[21－23]。如 Feng 等[22]采用一步電化學(xué)合成法制備了石墨烯/聚苯胺復(fù)合材料膜，并以此復(fù)合膜固定辣根過氧化物酶構(gòu)建了一種性能優(yōu)良的H2O2生物傳感器。然而，這些研究中所涉及的導(dǎo)電聚合物均為聚苯胺，有關(guān)PEDOT與石墨烯組成的復(fù)合材料在H2O2檢測方面的應(yīng)用研究尚未見文獻(xiàn)報道。此外，Pt具有優(yōu)越的催化特性，通過電沉積方法得到的Pt納米顆?？娠@著降低H2O2的過電位，增強(qiáng)其與電極之間的電子傳遞速率[7，10]。本文結(jié)合石墨烯、PEDOT 和 Pt納米顆粒的優(yōu)勢，首先以聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)功能化的石墨烯為載體原位聚合PEDOT制備PEDOT/PSSGraphene復(fù)合材料，隨后采用殼聚糖將該復(fù)合材料修飾于玻碳電極(GCE)表面制得PEDOT/PSSGraphene/GCE電極，并在此基礎(chǔ)上電沉積負(fù)載Pt納米顆粒構(gòu)建了一種新的Pt/PEDOT/PSSGraphene/GCE無酶H2O2生物傳感器。利用掃描電子顯微鏡(SEM)對制得的修飾電極進(jìn)行表征，通過電化學(xué)循環(huán)伏安和計時電流法研究了該傳感器對H2O2的響應(yīng)性能，并優(yōu)化了傳感器的制備和分析條件。結(jié)果表明，我們制備的傳感器對H2O2具有良好的電催化性能，表現(xiàn)出線性范圍寬、檢出限低、響應(yīng)快速以及重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性良好等優(yōu)點。

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

石墨烯(Graphene，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院施祖進(jìn)教授提供)由直流電弧法制得，純度大于99．9%;3，4－乙烯二氧噻吩(EDOT)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、殼聚糖(Sigma-Aldrich);30%過氧化氫(H2O2)、H2PtCl6·6H2O、葡萄糖、尿酸(UA)、抗壞血酸(AA)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水C2H5OH、H2SO4、FeCl3·6H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O(廣東西隴化工有限公司);冰乙酸(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司);L－酪氨酸(C9H11NO，L－Tyr)(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，生物試劑);實驗用水均為三次蒸餾水，所用試劑均為分析純，未進(jìn)一步純化。

PAR 273A型恒電位儀/恒電流儀(美國EG＆G公司)、KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、DZF－6020型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、H01－1C型恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)、Quanta 200型場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM，荷蘭Philips-FEI公司)，該電鏡配備有EDX系統(tǒng)。

1．2 PEDOT/PSS-Graphene復(fù)合材料的制備

稱取20 mg石墨烯加入到20 mL 1 mg/mL的PSS溶液中，超聲分散30 min后，加入 EDOT 200 μL，然后在攪拌下逐滴加入10 mL 14 mmol/L FeCl3溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h后，離心分離所制備的墨綠色漿液，并分別用無水乙醇和三次蒸餾水反復(fù)洗滌多次至洗滌液無色，收集固體，75℃下真空干燥12 h即制得PEDOT/PSS-Graphene復(fù)合材料。

1．3 Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE修飾電極的制備

修飾電極基底為玻碳電極(GCE，Φ=5 mm)，使用前分別用 5．0 μm、1．0 μm、0．3 μm Al2O3研磨粉研磨拋光，并用無水乙醇和三次蒸餾水超聲清洗后備用。稱取250 mg殼聚糖加入到50 mL 0．1 mol/L的乙酸溶液中，60℃下磁力攪拌2 h，制得0．5 wt%的殼聚糖溶液。稱取5 mg PEDOT/PSS-Graphene復(fù)合材料加入到1 mL上述殼聚糖溶液中，超聲分散10 min后移取10 μL懸液滴涂于GCE表面，室溫干燥后得到PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極。然后，將PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極置于5 mmol/L H2PtCl6溶液中，控制－0．25 V下恒電位沉積600 s，即可制得Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE修飾電極。為進(jìn)行比較還采用上述方法分別制備了PSSGraphene/GCE、PEDOT/PSS-Graphene/GCE、Pt/PSSGraphene/GCE和Pt/GCE電極。

1．4 電化學(xué)實驗

電化學(xué)實驗采用三電極體系，工作電極為所制備的修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑片電極。以0．05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(PBS，pH=8．0)為支持電解質(zhì)，加入不同量的H2O2制得電解液，電化學(xué)測量前先向電解液中通10 min氮氣以消除溶液中溶解氧的影響。進(jìn)行循環(huán)伏安測試時，電位掃描速率為100 mV/s。計時電流法測量在－0．45 V下進(jìn)行。所有測試于室溫25℃下進(jìn)行，本文所述電位均相對于SCE。

2 結(jié)果與討論

2．1 修飾電極的SEM表征

圖1分別給出PSS-Graphene/GCE、PEDOT/PSSGraphene/GCE、Pt/PSS-Graphene/GCE、Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE和Pt/GCE電極的SEM圖以及Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極的EDX能譜圖。從圖1(a)中可以看出，PSS功能化的石墨烯由于殼聚糖的固定在電極表面形成了粗糙的三維多孔結(jié)構(gòu)。聚合PEDOT后，修飾膜中的石墨烯仍呈現(xiàn)典型的折疊和褶皺形態(tài)(圖1(b))，這說明對石墨烯的功能化不會破壞其原有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。當(dāng)圖1(a)和1(b)中的兩電極上進(jìn)一步電沉積Pt納米顆粒后(圖1(c)和1(d))，表面上均形成了一些大小和形態(tài)不均一的球形結(jié)構(gòu)，EDX分析證實它們都含有Pt，S，O，C等元素，表明這些球形結(jié)構(gòu)都是復(fù)合材料。而直接沉積在GCE電極上的Pt則表現(xiàn)為不規(guī)則顆粒狀納米結(jié)構(gòu)(圖1(e))。此外，Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極的EDX能譜如圖1(f)所示，圖中包含Pt，S，C和 O等元素的信號，表明Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE修飾電極已成功制得。

圖1 石墨烯電極的SEM圖

2．2 傳感器制備和分析條件的優(yōu)化

2．2．1 EDOT 用量的優(yōu)化

制備PEDOT/PSS-Graphene復(fù)合材料時，在其他條件不變的情況下，控制EDOT單體的用量分別為 100 μL、150 μL、200 μL、250 μL 和 300 μL，測定傳感器對5 mmol/L H2O2還原的催化電流(圖2)。發(fā)現(xiàn)隨著EDOT用量的增加，催化電流逐漸增大，當(dāng)EDOT用量為200 μL時，催化電流最大，隨后若繼續(xù)增大EDOT用量，催化電流反而出現(xiàn)下降的趨勢。因此，本實驗制備傳感器時選擇 EDOT用量為200 μL。

圖2 EDOT用量對傳感器還原峰電流的影響

2．2．2 工作電位的優(yōu)化

控制其他條件不變時，采用計時電流法測定傳感器在不同工作電位下對5 mmol/L H2O2的電流響應(yīng)情況，如圖3所示。從圖3可知，當(dāng)工作電位為－0．45 V時，傳感器對H2O2的安培響應(yīng)最大，因此本實驗選擇－0．45 V作為傳感器的工作電位。

圖3 不同工作電位對傳感器安培響應(yīng)的影響

2．3 修飾電極的電化學(xué)行為

圖4 不同修飾電極在0．05 mol/L PBS(pH=8．0)中的循環(huán)伏安圖(掃描速率:100 mV/s)

圖4給出不同修飾電極分別在0．05 mol/L PBS(pH=8．0)以及在加有5 mmol/L H2O2的PBS中的循環(huán)伏安圖。比較圖中的曲線a，b，c和d可知，向PBS溶液中加入H2O2后，Pt/GCE和Pt/PSS-Graphene/GCE電極位于－0．34 V附近的還原電流信號均增大，指示這兩種電極都對H2O2還原表現(xiàn)出一定的催化作用。但Pt/PSS-Graphene/GCE對H2O2還原的催化電流明顯高于Pt/GCE，這可能是由于石墨烯具有優(yōu)良的電子傳遞性質(zhì)和較高的比表面積，從而促進(jìn)了修飾膜的電子轉(zhuǎn)移過程[24]。修飾PEDOT后(曲線e和f)，電流信號進(jìn)一步增大，表明Pt/PEDOT/PSSGraphene/GCE電極對H2O2還原具有更高的電催化活性。

圖5(a)是不同掃描速率下Pt/PEDOT/PSSGraphene/GCE 電極在 0．05 mol/L PBS(pH=8．0)溶液中記錄的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以看出，修飾電極上的氧化和還原峰電流均隨掃描速率的增加而增大，且還原峰電位向負(fù)方向移動，氧化峰電位向正方向移動。其還原峰電流Ip與掃描速率v呈線性關(guān)系(圖5(b))，線性方程為:Ip=－333．19－1．8229v，相關(guān)系數(shù)r=0．9961。表明在100 mV/s～350 mV/s掃描速率范圍內(nèi)電極反應(yīng)為準(zhǔn)吸附控制過程。

圖5 不同掃描速率下循環(huán)伏安圖和峰電流掃描速率校正曲線

2．4 傳感器的線性范圍和檢出限

圖6(a)為在優(yōu)化條件下于－0．45 V連續(xù)加入不同濃度 H2O2溶液后 Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極安培響應(yīng)的計時電流曲線，相應(yīng)的校正曲線如圖6(b)所示。從圖中可以看出，連續(xù)加入H2O2后，修飾電極的響應(yīng)電流較大。從電流時間曲線的局部放大圖可知，傳感器具有極快的響應(yīng)速度，加入H2O2后，響應(yīng)電流能很快達(dá)到平衡，平均響應(yīng)時間約1．5 s。此外，傳感器對H2O2的安培響應(yīng)與其濃度在11．57 μmol/L ～3．60 mmol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為:I=119．19c+90．83，相關(guān)系數(shù)為0．9998。還測得該傳感器的檢出限為9．27 μmol/L。與文獻(xiàn)報道的 PAA/Cyt C/L-Cys/Au(15 μmol/L ～0．48 mmol/L，3．5 μmol/L)[25]、Fe3O4MNPs/ITO(200 μmol/L ～ 2 mmol/L，10 μmol/L)[26]和 CAT/NiO-MWCNTs/GCE(200 μmol/L ～ 2．53 mmol/L，19 μmol/L)[27]電極的性能進(jìn)行比較，我們構(gòu)建的Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE傳感器對H2O2的檢測具有線性范圍寬、檢出限低、響應(yīng)快速等特點。

圖6 傳感器的安培響應(yīng)曲線及安培響應(yīng)對H2O2濃度的校正曲線

2．5 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為考察傳感器的重現(xiàn)性，平行做5支Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極，在含5 mmol/L H2O2的0.05 mol/L PBS(pH=8．0)中做循環(huán)伏安測試，其還原峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(R．S．D．)為4．7%，表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。Pt/PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極在含1 mmol/L H2O2的 0．05 mol/L PBS(pH=8．0)中于－0．45 V做計時電流測試，經(jīng)過3 600 s后，發(fā)現(xiàn)安培響應(yīng)仍能維持其初始響應(yīng)電流的93%，表明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2．6 傳感器的抗干擾性能

圖7為在－0．45 V 下，于0．05 mol/L PBS溶液(pH=8．0)中連續(xù)加入 1 mmol/L 的 H2O2、尿酸、葡萄糖、抗壞血酸和 L－酪氨酸時 Pt/PEDOT/PSSGraphene/GCE傳感器安培響應(yīng)的計時電流曲線。由圖7可知，只有在加入1 mmol/L H2O2時才出現(xiàn)明顯的響應(yīng)電流，而連續(xù)加入相同濃度的尿酸、葡萄糖、抗壞血酸和L－酪氨酸時不產(chǎn)生安培響應(yīng)，表明該傳感器具有良好的抗干擾性能。

圖7 －0．45 V 下于 0．05 mol/L PBS(pH=8．0)中連續(xù)加入1 mmol/L的H2O2，尿酸，葡萄糖，抗壞血酸和L－酪氨酸時傳感器的安培響應(yīng)

3 結(jié)論

本文首先以聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)功能化的石墨烯為載體原位聚合 PEDOT制備PEDOT/PSSGraphene復(fù)合材料，隨后將該復(fù)合材料修飾于玻碳電極(GCE)表面制得 PEDOT/PSS-Graphene/GCE電極，并在此基礎(chǔ)上電沉積負(fù)載Pt納米顆粒構(gòu)建了一種新的無酶H2O2生物傳感器。它對H2O2檢測有極快的響應(yīng)速度，且具有較寬的線性范圍、較低的檢出限以及良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和抗干擾性能。該研究對構(gòu)建高性能的無酶H2O2生物傳感器具有一定的指導(dǎo)意義。

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