曾習(xí)文 李 宏 夏立新 彭新凱 楊彥寧 黎 瑛

ZENG Xi-Wen1 LIHong2 XIA Li-Xin1 PENG Xin-Kai1 Y ANG Yan-Lin1 LIYing1

（1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.北京東方凱姆質(zhì)量認(rèn)證中心，北京 100021）

(1.Changsha Center of Supervision and Inspecetion on Food Quality Safety,Changsha,Hunan 410013,China;2.Beijing CAM Quality Certification Center,Chaoyang District,Beijing 100021,China)

3 ,4-苯并（α）芘又稱苯并芘（benzopyrene），是一種由5個(gè)苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳烴，其性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水，溶于苯、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，是一種很強(qiáng)的致癌物質(zhì)，可誘變皮膚、肺和消化道癌癥[1-3]，并有一定的致畸作用[4]。

熏燒烤肉深受消費(fèi)者喜愛，但在煙熏、燒烤、油炸肉制品過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生致癌物質(zhì)3,4-苯并(α)芘[5,6]?，F(xiàn)有檢測(cè)方法主要有高效液相色譜—熒光檢測(cè)器法[7-9]，氣相色譜—質(zhì)譜法[10-12]，氣相色譜—高分辨質(zhì)譜法[13]，紫外分光光度法[14]，但其前處理都存在不同程度的缺陷，以致在實(shí)際工作中很難開展。

胡奇杰等[6]采用正己烷提取結(jié)合C18小柱固相萃取凈化法對(duì)肉制品進(jìn)行前處理，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)樣品凈化時(shí)不需要繁瑣的操作，但使用了比較昂貴的C18固相萃取小柱，使得檢測(cè)成本顯著上升；中國(guó)NY/T 1666——2008中采用環(huán)己烷提取結(jié)合二甲亞砜—環(huán)己烷反提凈化法對(duì)肉制品進(jìn)行前處理，這種方法不需要昂貴材料（C18固相萃取小柱），但是操作過(guò)程繁瑣，且可操作性很差，不利于對(duì)大量樣品進(jìn)行同時(shí)處理。本試驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上，改進(jìn)了肉制品中苯并芘檢測(cè)的前處理方法，采用安全性更高的乙酸乙酯作為提取溶劑，通過(guò)提取、濃縮、再反提凈化的方法，結(jié)合高效液相色譜—熒光檢測(cè)器對(duì)肉制品中苯并芘殘留實(shí)現(xiàn)快捷有效的測(cè)定，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)成本，同時(shí)減少了對(duì)環(huán)境的污染，真正意義上實(shí)現(xiàn)了環(huán)境友好型檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)默克公司；

乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、石油醚、環(huán)己烷、正己烷、無(wú)水硫酸鈉、三氧化二鋁：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)品：10 μg/mL，國(guó)家標(biāo)物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（帶熒光檢測(cè)器）：LC-20AT型，島津公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

超聲波清洗機(jī)：SB-25-12DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

離心機(jī)：CT14D型，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；

氮吹儀：HGC-24A型，北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

固相萃取小柱：C18型，美國(guó)沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液及標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制 將1mL標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/mL）加入到10mL棕色容量瓶中，甲醇定容得濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（A液），0～5℃避光保存。分別吸取定量A液于10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成0.0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，100.0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse PAH 4.6×250mm，5μm；流動(dòng)相：A為超純水，B為色譜純乙腈；采用等度洗脫（乙腈∶水=90∶10），洗脫時(shí)間：20min；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為384 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為406 nm；以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

1.3.3 樣品處理 取肉制品，切碎，攪拌機(jī)搗碎，稱取10 g左右樣品于50mL離心管中，加入2 g無(wú)水硫酸鈉，20mL乙酸乙酯，渦旋混勻1min，超聲提取10min，10 000 r/min離心3min，傾出上清液，20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并提取液，旋蒸濃縮至近干，5mL石油醚轉(zhuǎn)移濃縮液至10 mL比色管中，氮吹至干，加入2mL甲醇，渦旋1min，0.45μm尼龍濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

以往的文獻(xiàn)[6]和標(biāo)準(zhǔn)[15]中，提取溶劑都限于石油醚、環(huán)己烷、正己烷等極性很小的溶劑，雖然這些溶劑對(duì)苯并芘溶解性都很好，但對(duì)肉制品中苯并芘的提取能力如何還沒有人進(jìn)行過(guò)考究。一種好的提取溶劑應(yīng)該具備兩個(gè)特點(diǎn)：①對(duì)目標(biāo)物要有良好的溶解性，②溶劑要具有對(duì)樣品良好的滲透能力。為了找到更加適合肉制品中苯并芘殘留提取的有機(jī)溶劑，對(duì)不同極性有機(jī)溶劑提取能力進(jìn)行了比較。結(jié)果見表1。

不同溶劑提取效果試驗(yàn)結(jié)果顯示，提取能力二氯甲烷最強(qiáng)，乙酸乙酯次之，這可能與二氯甲烷、乙酸乙酯強(qiáng)的滲透力（對(duì)樣品）及良好的溶解性（對(duì)目標(biāo)物）有關(guān)。由于二氯甲烷毒性較大，對(duì)人體有很大危害且價(jià)格較乙酸乙酯昂貴，綜合考慮環(huán)保和經(jīng)濟(jì)因素，最終選擇乙酸乙酯作為提取肉制品中苯并（α）芘的溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

取同一批次陰性肉制品，切碎，攪拌機(jī)搗碎，稱取樣品（10±0.01）g，5 個(gè)平行，3 種標(biāo)樣添加水平（5，50，500 ng）。樣品置于50mL離心管中，加入2 g無(wú)水硫酸鈉，加入20mL乙酸乙酯，渦旋混勻1min，超聲提取10min，10 000 r/min離心3 min，傾出上清液，20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并提取液，旋蒸濃縮至近干，5mL石油醚轉(zhuǎn)移濃縮液至10mL比色管中，氮吹至干。分別選用C18小柱固相萃取法、甲醇反提法、乙腈反提法、中性氧化鋁過(guò)柱法、二甲亞砜—環(huán)己烷反提法5種方法分別對(duì)乙酸乙酯超聲提取濃縮物進(jìn)行凈化處理，所得結(jié)果見表2。

表1 不同溶劑提取樣品中3,4-苯并(α)芘結(jié)果對(duì)比Table1 Resultsabout3,4-benzo(α)pyrene in sampleby different reagentextracting

表2 不同凈化方式結(jié)果對(duì)比Table2 Resultsweregiven by differentpurifyingmethod

試驗(yàn)結(jié)果顯示：操作性方面，甲醇反提法與乙腈反提法占優(yōu)勢(shì)，而C18小柱固相萃取法、中性氧化鋁過(guò)柱法[15]及二甲亞砜—環(huán)己烷反提法均需要復(fù)雜的處理過(guò)程，在對(duì)大量肉制品進(jìn)行前處理時(shí)明顯不適應(yīng)；回收率方面，用中性氧化鋁過(guò)柱法凈化時(shí)回收率最高（90.3%），甲醇反提法次之（87.7%），乙腈反提法（81.5%），二甲亞砜—環(huán)己烷反提法及C18小柱固相萃取法較差。中性氧化鋁過(guò)柱法操作繁瑣且需要使用大量溶劑，對(duì)環(huán)境會(huì)造成一定程度污染，同時(shí)成本也相對(duì)較高；而乙腈反提法回收率（81.5%）較甲醇反提法要低（87.7%），并且乙腈價(jià)格高于甲醇，對(duì)環(huán)境的污染也較大。綜合考慮成本及環(huán)境因素前提下，最終選擇甲醇反提法作為肉制品中苯并芘檢測(cè)的凈化方法。分析認(rèn)為甲醇反提能達(dá)到凈化的目的與甲醇對(duì)油脂的溶解性不好，對(duì)目標(biāo)化合物苯并芘有一定溶解性，且在油脂中的滲透性較好有關(guān)，也就為濃縮液凈化提供了方便。

2.3 檢測(cè)方法比對(duì)

為了得到一種簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的肉制品中苯并芘殘留量檢測(cè)方法，需要對(duì)現(xiàn)有報(bào)道方法[6,15]進(jìn)行改進(jìn)，并將改進(jìn)后的方法與前人報(bào)道方法進(jìn)行比對(duì)，所得結(jié)果見表3。

3 種方法測(cè)定肉制品中苯并芘含量時(shí)：胡奇杰等[6]采用正己烷提取結(jié)合C18小柱固相萃取凈化法對(duì)肉制品進(jìn)行前處理，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)樣品凈化時(shí)不需要繁瑣的操作，但使用了比較昂貴的C18固相萃取小柱，使得檢測(cè)成本顯著上升，且回收率（73.0%）也不太理想，不適合大批量肉制品中苯并芘殘留量檢測(cè)的前處理；中國(guó)NY/T 1666——2008中采用環(huán)己烷提取結(jié)合二甲亞砜—環(huán)己烷反提凈化法對(duì)肉制品進(jìn)行前處理好，這種方法不需要昂貴的材料(C18固相萃取小柱)，但操作過(guò)程繁瑣，且可操作性很差，回收率（67.5%）較低，不適于對(duì)大量樣品進(jìn)行同時(shí)處理。本試驗(yàn)采用乙酸乙酯超聲提取、旋蒸濃縮、甲醇反提凈化對(duì)肉制品進(jìn)行前處理，其操作過(guò)程簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低廉，對(duì)環(huán)境污染較小，且有很強(qiáng)的可行性（回收率達(dá)到87.7%）和很好的穩(wěn)定性（RSD小于2.5%），很適合對(duì)大量肉制品同時(shí)進(jìn)行前處理，能真正意義上實(shí)現(xiàn)肉制品中苯并芘殘留量的快速檢測(cè)。

2.4 回歸方程、檢出限、回收率、精密度

表3 不同檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比Table3 Resultsweregiven by differentdeterminingmethod

配制濃度為 0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，100.0 ng/mL的3,4-苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，依次進(jìn)樣，以所得峰面積為橫坐標(biāo)（X），標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)測(cè)得3,4-苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在0.5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)，其線性回歸方程為Y=4.095×10-5X-4.449×10-2，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9，表明線性關(guān)系良好。

對(duì)空白樣品進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比作為方法檢出限，10倍信噪比作為方法定量限。肉制品中苯并芘的檢出限為0.15μg/kg，定量限為0.50μg/kg。以3種濃度添加水平重復(fù)測(cè)定5次，分別計(jì)算各種濃度添加水平回收率及精密度，檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和可行性，所得結(jié)果見表4。

表4 不同濃度添加水平回收率及精密度Table4 Recovery and precision atdifferentddition levels

由表4可知，3種濃度添加水平的回收率都大于87%，保證了本試驗(yàn)檢測(cè)方法的可行性；而精密度均小于2.4%則保證了結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

2.5 不同樣品的檢測(cè)

選取牛肉、豬肉、兔肉、雞肉、羊肉、魚肉、香腸、豬舌尖、豬臉，用本試驗(yàn)報(bào)道方法檢測(cè)，每種樣品取5個(gè)平行，所得結(jié)果見表5。

表5 不同樣品檢測(cè)結(jié)果Table5 Determining resultsofdifferentsample

試驗(yàn)結(jié)果表明，將本方法應(yīng)用到不同肉制品中苯并芘進(jìn)行前處理時(shí)，平行性非常好（RSD均小于2.5%），表明此方法穩(wěn)定可靠，完全可以作為肉制品中苯并芘殘留量檢測(cè)的前處理方法。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)乙酸乙酯超聲提取、旋蒸濃縮、甲醇反提凈化對(duì)肉制品進(jìn)行前處理，進(jìn)而結(jié)合高效液相色譜儀—熒光檢測(cè)器測(cè)定肉制品中3,4-苯并(α)芘殘留量，結(jié)果表明：3種濃度添加水平樣品（5，50，500 ng）經(jīng)乙酸乙酯超聲提取兩次、旋蒸濃縮、甲醇反提凈化后，回收率分別為87.4%，88.1%，87.6%，精確度分別為2.37%，2.06%，1.83%，方法檢出限為0.15μg/kg。本方法可行性大，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性好，與文獻(xiàn)[6]、[15]的方法相比具有更穩(wěn)定、更準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單、低污染、低成本等優(yōu)勢(shì)，符合環(huán)境友好型檢測(cè)要求，適合肉制品中3,4-苯并(α)芘殘留量檢測(cè)。

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