雷建平，葉 慧，馮定遠(yuǎn)，左建軍*

（1.廣東溫氏食品集團(tuán)稔村分公司，廣東 云浮 527422；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510630）

脂肪酶是一種水解酶，在有水條件下能夠作用于甘油三酯的羧基釋放脂肪酸和甘油。其天然底物是長鏈甘油三酯，長鏈甘油三酯在水中溶解性很低，水解反應(yīng)在油-水界面催化。脂肪酶是廣泛存在于各類動(dòng)物、植物和微生物中的一種酶，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，具有顯著的生理意義和生產(chǎn)應(yīng)用的潛能[1]。微生物源脂肪酶種類豐富，包括細(xì)菌、霉菌和酵母等來源，產(chǎn)生的脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶作用更廣的反應(yīng)pH、溫度范圍以及反應(yīng)底物。目前，微生物脂肪酶主要應(yīng)用在洗滌去污、食品加工、造紙工業(yè)、有機(jī)化學(xué)、生物轉(zhuǎn)換、油脂化工等領(lǐng)域[2-3]。

以動(dòng)物消化道作為酶反應(yīng)場所，其環(huán)境既具有穩(wěn)定性又有不可控性，特定動(dòng)物的消化道其特定部位的pH、溫度基本是穩(wěn)定的，但動(dòng)物生理狀態(tài)和日糧品種等許多因素不可控。相對于植物和動(dòng)物源脂肪酶而言，微生物脂肪酶具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，因此更適合作為飼料添加劑作用于動(dòng)物腸道，促進(jìn)動(dòng)物腸道內(nèi)脂質(zhì)消化和吸收。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脂肪酶：微生物脂肪酶單酶A、B、C、D，由4家不同酶制劑公司提供。其中酶A、B來源于黑曲霉，酶C、D來源于假絲酵母。油脂：豬油、魚油、棕櫚油、豆油、花生油由廣州某油廠提供。試驗(yàn)試劑：對硝基苯酚、對硝基苯酚丁酸酯（pNPB，C4）、對硝基苯酚辛酸酯（pNPO，C8）、對硝基苯酚月桂酸酯（pNPL，C12）、對硝基苯酚棕櫚酸酯（pNPP，C16）購于Sigma公司，其他均為分析純。

1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、臺(tái)式低溫離心機(jī)、移液槍、高速勻漿機(jī)、pH計(jì)、電磁攪拌器、酶標(biāo)儀、超聲波粉碎機(jī)、滴定管等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶液制備

精確稱取一定量酶粉用Tris-Hcl緩沖液溶解，用電磁攪拌器攪拌30min，將全部溶液小心倒入50mL離心管中，沉淀部分再加一定量的緩沖液，如此反復(fù)洗3～4次，最后全部溶液移入50mL離心管，3 000 rpm離心10min。吸取上清液至定容瓶，沉淀部分再加一定量的緩沖液離心，反復(fù)2～3次，上清液定容至50mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脂肪酶酶活測定方法

電位滴定法：參考《GB/T 23535-2009脂肪酶制劑》采用電位滴定法，即使用橄欖油為底物，通過檢測反應(yīng)釋放的脂肪酸或甘油來檢測酶活力。以不同的對硝基苯酯為反應(yīng)底物，1為以對硝基苯酚的絕對量（μmol）為橫坐標(biāo)，OD405值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見附圖。

附圖 對硝基苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 脂肪酶水解專一性的測定

利用比色法，在pH 7.0的條件下，40℃水浴，以具有不同長度碳鏈的對硝基苯酚酯為底物，即pNPB、pNPO、pNPL、pNPP，并測定不同脂肪酶的相對酶活，重復(fù)3次計(jì)算平均值。

1.3.4 脂肪酶最適反應(yīng)pH的測定

利用比色法，酶反應(yīng)體系中緩沖液的pH分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以 pNPO 為 底物 ，40℃水浴測定不同脂肪酶相對酶活，重復(fù)3次計(jì)算平均值。

1.3.5 脂肪酶最適反應(yīng)溫度的測定

利用比色法，在pH 7.0的緩沖液中，以pNPO為底物，測定脂肪酶在30、40、50、60、70℃下的相對酶活，重復(fù)3次計(jì)算平均值。

1.3.6 脂肪酶對天然油脂水解效果的測定

利用電位點(diǎn)滴法，分別以橄欖油、豬油、魚油、棕櫚油、豆油、花生油作為水解底物，比較不同脂肪酶水解能力，重復(fù)3次計(jì)算平均值。其中以橄欖油為底物測定的絕對酶活為100%，計(jì)算其他底物條件下的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶水解專一性測定

4種脂肪酶對不同鏈長底物的水解結(jié)果見表1。

表1 不同底物條件下脂肪酶的相對酶活 %

由表1可知，脂肪酶A最優(yōu)水解底物為C12，脂肪酶B、C、D最優(yōu)水解底物均為C8；除脂肪酶A對C16水解效果達(dá)到28.74%外，其余3種脂肪酶對C16水解效果均低于10%，可見4種脂肪酶對含長鏈脂肪酸酯水解效果都沒有水解含中短鏈脂肪酸酯的效果好。

2.2 脂肪酶最適pH的測定

4種脂肪酶最適反應(yīng)pH的測定結(jié)果見表2。

表2 不同pH條件下脂肪酶的相對酶活 %

由表2可知，脂肪酶A、C、D的最適pH均為9.0，脂肪酶B的最適pH為8.0。4種脂肪酶在酸性條件下（pH=5.0或6.0），水解效果均不如最適pH條件，在pH 5.0的條件下，4種脂肪酶相對酶活分別只有最適pH條件下的1.15%、0.40%、0%、1.68%，其中脂肪酶C在酸性條件下相對酶活最低，脂肪酶D在酸性條件下相對酶活最高；但總體而言，4種脂肪酸在酸性條件下水解效果都不理想，均屬于弱堿性脂肪酶。

2.3 脂肪酶最適溫度的測定

4種脂肪酶最適反應(yīng)溫度的測定結(jié)果見表3。

表3 不同溫度條件下脂肪酶的相對酶活 %

由表3可知，脂肪酶A、B的最適溫度均為40℃，脂肪酶C、D的最適溫度為60℃，可見4種脂肪酶中黑曲霉源的脂肪酶最適溫度低于假絲酵母源的脂肪酶。脂肪酶A、B、D在70℃條件下只有最適溫度條件下的24.01%、29.90%、18.92%相對酶活，而脂肪酶C在70℃條件下仍保持99.52%的相對酶活，表明脂肪酶C具有很好的耐熱性。但脂肪酶C、D在接近動(dòng)物體內(nèi)溫度（40℃）條件下分別只有47.12%、34.86%相對酶活，比黑曲霉源脂肪酶低。

2.4 脂肪酶對天然油脂水解效果的測定

在pH為7.0，溫度為40℃條件下，由滴定法以橄欖油為底物測得脂肪酶A為1 193.94U·g-1，脂肪酶B為1 599.84 U·g-1，脂肪酶C為1 178.12 U·g-1，脂肪酶D為1 509.01 U·g-1，脂肪酶B酶活濃度最高。

4種脂肪酶對天然油脂水解效果見表4。

表4 水解不同天然油脂脂肪酶相對酶活 %

由表4可知，脂肪酶A和B對豬油和棕櫚油水解效果最差，脂肪酶C對各種天然油脂水解效果都較好，僅對豬油水解效果較差。除豬油外，脂肪酶D對魚油、棕櫚油、花生油水解效果最好。4種脂肪酶對各種天然油脂水解效果各有差異，pH為7.0，溫度為40℃條件下，脂肪酶C、D優(yōu)于脂肪酶A、B。

3 討論

3.1 脂肪酶酶學(xué)特性

微生物脂肪酶屬于中性或堿性脂肪酶[4]。但是也有一些酸性脂肪酶，例如Aspergillus niger NCIM 1207脂肪酶的最適pH是2.5[5]。來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌SB-1，萎縮芽孢桿菌SB-2和地衣芽孢桿菌SB-3的脂肪酶具有較廣的pH范圍（pH 3～12）[6]。也有研究表明微生物脂肪酶具有最適溫度更低或者更高的范圍[7-9]。

Gupta等把微生物脂肪酶分為非特異性、特異選擇性和底物特異性基礎(chǔ)上的脂肪酸特異性[1]。非特異性脂肪酶隨機(jī)作用于甘油三酯分子，將其完全水解為脂肪酸和甘油。與此相反，特異性脂肪酶是1,3位特異性脂肪酶，只水解甘油三酯C1和C3酯鍵，從而產(chǎn)生游離脂肪酸、1,2-甘油二脂、2,3-甘油二酯或2-甘油單脂。第3類脂肪酶包含脂肪酸特異性脂肪酶，其表現(xiàn)為顯著的脂肪酸優(yōu)先水解性。不同菌種來源的脂肪酶水解特性不同，本試驗(yàn)選用4種不同的脂肪酶，分別由黑曲霉或假絲酵母發(fā)酵而來。黑曲霉源脂肪酶對1，3位脂肪酸具有特異水解性，假絲酵母源脂肪酶是一種非特異性脂肪酶，能夠同時(shí)水解甘油三酯1，2，3位上的酯鍵，所以黑曲霉源脂肪酶水解產(chǎn)物更多是游離脂肪酸和2-甘油單酯，而假絲酵母源脂肪酶的水解產(chǎn)物則為更為廣泛，包括游離脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油[10]。

3.2 飼用脂肪酶的評價(jià)

飼料酶的選用和酶品質(zhì)的評判涉及很多因素，遠(yuǎn)比普通的工業(yè)用酶復(fù)雜。一般的工業(yè)用酶反應(yīng)場所比較固定，且可控性強(qiáng)，有比較穩(wěn)定的pH、溫度、底物和反應(yīng)時(shí)間，而且酶成分也比較單一明確[11]。但是對于飼料酶，由于飼料原料、加工要求和動(dòng)物消化道環(huán)境的多樣性，需要考慮的因素眾多且復(fù)雜，酶反應(yīng)環(huán)境可控性低，因此酶的評判指標(biāo)和選用標(biāo)準(zhǔn)目前在我國都很難建立。

對不同來源的酶制劑特性及最佳反應(yīng)條件的認(rèn)識(shí)是外源酶應(yīng)用的前提條件，外源酶制劑的最佳作用條件應(yīng)與動(dòng)物體內(nèi)消化道內(nèi)環(huán)境一致，才具有重要的實(shí)際意義[12]。基于一定的動(dòng)物品種和日糧類型，根據(jù)主要影響脂肪酶反應(yīng)效果的指標(biāo)，可以確立主要的飼料酶選用標(biāo)準(zhǔn)，例如酶活力、最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度、耐熱性、耐酸性、抗蛋白酶性、作用底物等。

微生物源脂肪酶來源廣泛，但是大部分是由應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域的脂肪酶轉(zhuǎn)而應(yīng)用于飼料添加劑領(lǐng)域，由于飼料行業(yè)或者動(dòng)物消化的特殊性，對脂肪酶的選擇具有一定的特異性要求。對單胃動(dòng)物而言，其體溫一般為37～40℃，消化道pH存在較寬的范圍。根據(jù)肉雞消化道環(huán)境和消化道食糜排空速度，本試驗(yàn)認(rèn)為最適反應(yīng)pH為5.0～7.0，反應(yīng)溫度約為40℃，耐酸性和抗蛋白酶特性較好的脂肪酶比較適合應(yīng)用于肉雞日糧[13-14]。

本試驗(yàn)選用的4種脂肪酶均屬于弱堿性脂肪酶，最適pH為8～9，酸性條件下水解效果均不理想。脂肪酶A、B的最適反應(yīng)溫度為40℃，脂肪酶C、D最適反應(yīng)溫度為60℃，相比而言脂肪酶A和B更適合于消化道溫度。4種脂肪酶對各種天然油脂水解效果各有差異，針對不同的油脂應(yīng)選用不同的脂肪酶。

[1]Gupta R,Gupta N,Rathi P.Bacterial lipases:an overview of production,purification and biochemical properties[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64（6）:763-781.

[2]Sharma R,ChistiY,Banerjee UC.Production,purification,characterization,and applications of lipases[J].Biotechnology Advances,2001,19（8）:627-662.

[3]Hasan F,Shah A A,Hameed A.Industrialapplicationsofmicrobial lipases[J].Enzyme and Microbial Technology,2006,39（2）:235-251.

[4]舒正玉.黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)、基因克隆與表達(dá)及結(jié)構(gòu)預(yù)測[D].武漢:華中科技大學(xué),2007.

[5]Mahadik ND,Puntambekar U S,Bastawde K B,etal.Production of acidic lipase by Aspergillusniger in solid state fermentation[J].ProcessBiochemistry,2002,38（5）:715-721.

[6]Bradoo S,Saxena R K,Gupta R.Two acidothermotolerant lipases from new variants of Bacillus spp[J].World Journal of Microbiol Biotechnol,1999（15）:87-91.

[7]Luo Y,Zheng Y T,Jiang Z B,etal.A novel psychrophilic lipase from Pseudomonas fluorescenswith unique property in chiral resolution and biodiesel production via transesterification[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73（2）:349-355.

[8]Lee DW,Koh Y S,Kim K J,etal.Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1[J].FemsMicrobiology Letters,1999,179:393-400.

[9]Sunna A,Hunter L,Hutton C A,et al.Biochemical characterization ofa recombinant thermoalkalophilic lipase and assessmentof its substrate enantioselectivity[J].Enzyme and Microbial Technology,2002,31（4）:472-476.

[10]NamboodiriVM,Chattopadhyaya R.Purification and biochemical characterization ofa novel thermostable lipase from aspergillusniger[J].Lipids,2000,35（5）:495-502.

[11]陸文清,李德發(fā).評價(jià)飼料酶品質(zhì)的5種指標(biāo)[J].飼料研究,2005（3）:10-13.

[12]馮定遠(yuǎn),左建軍.飼料酶制劑技術(shù)體系的研究與實(shí)踐[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2011.

[13]張鐵鷹.植酸酶體外消化評定技術(shù)的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2002.

[14]樊紅平,侯水生,劉建華,等.食糜在雞、鴨消化道排空速度的比較研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34（4）:7-10.