李志山, 鄭李娜, 郭永清

（山西省人民醫(yī)院麻醉科, 太原 030012）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指患者在術(shù)前沒有精神異常的表現(xiàn)，在圍術(shù)期多種因素影響下，出現(xiàn)腦功能紊亂，表現(xiàn)為焦慮、認(rèn)知、行為、意志的改變及記憶受損等[1]。研究表明，早期POCD多與高齡、麻醉時間長、教育水平低、術(shù)后肺部并發(fā)癥、患者二次手術(shù)和術(shù)后感染等因素有關(guān)，全身麻醉藥的過度作用被認(rèn)為是引起POCD的主要誘因之一[2]。七氟烷由于具有誘導(dǎo)、蘇醒迅速，刺激性小等優(yōu)點(diǎn)，在臨床麻醉中被廣泛使用。但七氟烷麻醉是否會影響患者的學(xué)習(xí)、記憶能力，仍存在爭議。本研究擬通過Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）實(shí)驗(yàn)及檢測血清、海馬組織中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）的水平，來推測七氟烷是否影響成年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器

七氟烷（美國雅培制藥有限公司，批號0527，250ml/瓶），NSE測定試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司），MWM及圖像自動監(jiān)測系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只（體質(zhì)量350～400g，由山西醫(yī)科大學(xué)動物室提供）隨機(jī)分成4組，每組10只：（1）1%七氟烷組；（2）2%七氟烷組；（3）3%七氟烷組；（4）對照組（吸入空氣），3個實(shí)驗(yàn)組分別采用1%，2%，3%的七氟烷麻醉3h，而對照組不做任何處理。

1.3 麻醉方法

麻醉箱為透明塑料材質(zhì)，外形大小為55cm×45cm×40cm。麻醉氣體由麻醉機(jī)（Datex-Ohmeda公司，芬蘭）輸出端輸出，由箱子一側(cè)距頂部5cm一小孔進(jìn)入箱內(nèi)，在箱子另一側(cè)壁再留一小孔與麻醉機(jī)輸出端連接和麻醉氣體監(jiān)測儀相連，持續(xù)監(jiān)測七氟烷濃度。麻醉箱內(nèi)部分為上下兩層，下層鋪有鈉石灰吸收CO2，以防止麻醉箱內(nèi)CO2蓄積。麻醉前1天，先將大鼠置于麻醉箱內(nèi)，讓其自由活動15min，以熟悉麻醉箱內(nèi)的環(huán)境，防止麻醉初期出現(xiàn)驚恐不安。大鼠麻醉蘇醒1h后，恢復(fù)飼養(yǎng)。

1.4 Morris水迷宮測試

水迷宮為一直徑150cm、高50cm的圓形水池，水池內(nèi)壁及底部均被漆為黑色，池內(nèi)水深約25cm，水溫保持在（22±2）℃，房間內(nèi)光照恒定，無光線反射在水池內(nèi)。池壁上以4個等距離點(diǎn)將水池分為4個象限，在目標(biāo)象限（設(shè)為第二象限）中央處放一個直徑為12cm、高23cm的圓形黑色站臺，站臺位于水面下約2cm。池壁內(nèi)貼有不同形狀及顏色的標(biāo)記物。迷宮上方安置著連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動。采用MWM視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行信息處理，該系統(tǒng)能動態(tài)記錄大鼠在水迷宮中游泳的錄像資料，設(shè)定分析參數(shù)，進(jìn)行在線或離線數(shù)據(jù)分析。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：每次將大鼠放入水中前，先將大鼠置于平臺上適應(yīng)約15s，隨后將大鼠隨機(jī)從不同象限的入水點(diǎn)面壁放進(jìn)水池中，將電腦設(shè)計(jì)為大鼠登上平臺3s后終止記錄，該記錄為尋找平臺的潛伏期時間，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)最長記錄時間為60s，若大鼠在60s內(nèi)仍然不能上臺，則認(rèn)為其逃避潛伏期為60s，并引導(dǎo)其登上平臺適應(yīng)15s，每次測試結(jié)束擦干后放入鼠籠，每只大鼠每天分別在4個象限各測試1次，一直持續(xù)5d。通過測量平臺的潛伏期時間，評價(jià)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；通過大鼠游泳的平均總路程來判斷大鼠的活動能力。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)的第6天，撤除站臺，然后將各只大鼠隨機(jī)從第一、四象限面壁放入池內(nèi)，各測試1次，同步記錄大鼠在60s內(nèi)的游泳軌跡并對其進(jìn)行分析。通過測量大鼠在目標(biāo)象限活動時間的比率和穿越平臺的次數(shù)，以評判大鼠的空間記憶能力。

1.5 血清及海馬組織中NSE測定

在吸入七氟烷或空氣后第6天，完成空間探索實(shí)驗(yàn)后，將每組存活大鼠，腹腔注射水合氯醛（2%，50mg/kg）麻醉，固定于清潔的操作臺上，從尾靜脈采集5ml血液置于離心管中，靜置約5min后，用離心機(jī)3000×g，離心5min，分離血清，將血清分為兩份置于-80℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定血清中NSE濃度。取血后，斷頭，在冰皿中分離出海馬，用生理鹽水清洗干凈，裝入試管，-80℃冰箱保存。測試時，解凍后制作成10%的溶漿，離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定NSE在海馬組織中的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。MWM實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料的方差分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠認(rèn)知功能測試結(jié)果

定位航行實(shí)驗(yàn)表明，在同一時間點(diǎn)，吸入不同濃度七氟烷的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，大鼠的平均逃避潛伏期和總路程差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖1）；同時，不同濃度七氟烷組間比較，大鼠的平均逃避潛伏期和總路程差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖1）。吸入七氟烷或空氣后第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組大鼠的目標(biāo)象限停留時間百分比和平均穿越平臺次數(shù)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖2）。

2.2 大鼠血清及海馬組織中NSE含量

1%七氟烷組和3%七氟烷組大鼠血清中NSE濃度低于對照組（P＜0.01；圖3A）；同時，2%七氟烷組和3%七氟烷組大鼠血清中NSE濃度高于1%七氟烷組（P＜0.01，P＜0.05；圖3A）。大鼠10%海馬組織溶漿中NSE含量，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖3B）。

3 討 論

研究表明，POCD是手術(shù)和麻醉誘發(fā)的，多種因素聯(lián)合作用所致的神經(jīng)功能減退。因此了解術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后可能存在的誘發(fā)因素，盡量避免并及時處理，對手術(shù)的順利進(jìn)行和術(shù)后康復(fù)，減少POCD的發(fā)生具有重要的意義。一些研究認(rèn)為全身麻醉可以損害大鼠的空間記憶能力[3]，但其機(jī)制仍然不十分清楚。

研究顯示，成年大鼠七氟烷的最低肺泡濃度（minimum alveolar concentration，MAC）為2.5%[4]，而滿足常用臨床手術(shù)所需最低有效肺泡濃度為1.2～1.3MAC。方強(qiáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，0.65MAC的七氟烷麻醉對大鼠短期學(xué)習(xí)記憶能力無明顯的影響。因此本研究中，我們選用了1%七氟烷、2%七氟烷、3%七氟烷3種吸入濃度進(jìn)行研究比較。

圖1 定位航行實(shí)驗(yàn)中吸入不同濃度七氟烷大鼠的逃避潛伏期(A)和總路程(B)Figure 1 Effects of different dosages of sevoflurane treatment on the escape latency (A) and path length (B) during the place navigation test in rats

圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)中吸入不同濃度七氟烷大鼠的目標(biāo)象限停留時間百分比(A)和平均穿越平臺次數(shù)(B)Figure 2 Effects of different dosages of sevoflurane treatment on the percentage of the time spent in the target quadrant (A) and crossing platform frequency (B) during the spatial probe test in rats

圖3 吸入不同濃度七氟烷大鼠血清中NSE含量(A)和海馬組織中NSE含量(B)Figure 3 Effects of different dosages of sevoflurane treatment on the NSE in the serum (A) and NSE in the hippocampus (B) in rats NSE: neuron specific enolase.Compared with control group, ** P＜0.01; Compared with 1% sevoflurane group, #P＜0.05, ##P＜0.01

MWM是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型[6,7]，逃避潛伏期直接反映了空間信息獲取的學(xué)習(xí)能力，空間探索實(shí)驗(yàn)反映了記憶儲存及提取再現(xiàn)的能力。本研究中，各組成年大鼠在定位航行試驗(yàn)中，平均逃避潛伏期和總路程等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明單次吸入1%七氟烷、2%七氟烷、3%七氟烷麻醉對成年大鼠空間學(xué)習(xí)能力沒有明顯影響。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠目標(biāo)象限停留時間百分比、穿越平臺次數(shù)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明七氟烷麻醉對大鼠空間記憶能力沒有影響。但是佘高明等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，單次吸入3%七氟烷2h可導(dǎo)致成年大鼠麻醉后1d內(nèi)自發(fā)活動減少，2個月內(nèi)空間學(xué)習(xí)與記憶能力損傷。由于本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了單次吸入七氟烷3h后6d內(nèi)的行為學(xué)的研究，其長期空間學(xué)習(xí)記憶能力是否有影響有待進(jìn)一步研究。徐敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，1MAC七氟烷麻醉結(jié)束后早期，麻醉組小鼠在水迷宮訓(xùn)練期第2～4天的潛伏期和游泳路程較對照組明顯縮短，而在反映長期記憶能力的探索實(shí)驗(yàn)中，麻醉組小鼠在平臺象限滯留時間和平臺象限滯留時間百分比明顯長于對照組，這說明七氟烷能增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究中，大鼠的行為學(xué)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與單次吸入七氟烷且樣本量小有關(guān)，我們會在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，繼續(xù)加大樣本量和測試時間，來更加深入細(xì)致地研究七氟烷對大鼠的行為學(xué)影響。

海馬是參與學(xué)習(xí)記憶的主要腦功能區(qū)，與認(rèn)知功能有著密切的聯(lián)系[10?12]。正常情況下，血液中NSE含量很低，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，NSE才從神經(jīng)元中釋放出來，通過血腦屏障進(jìn)入血液和腦脊液，故檢測血清NSE含量可反映神經(jīng)元死亡的程度[13,14]。本研究結(jié)果顯示，吸入七氟烷不但沒有引起NSE的升高，而且吸入1%、3%七氟烷可以減少血清中的NSE水平，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。雖然海馬組織溶漿中NSE水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但海馬組織中NSE水平和血清中的NSE趨勢相似。

綜上所述，單次吸入1%，2%和3%的七氟烷，短期內(nèi)不影響成年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。同時血清中NSE水平的降低，表明吸入1%和3%的七氟烷不會引起大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的損害。

致謝

特別感謝山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室張華屏老師在實(shí)驗(yàn)中給予的指導(dǎo)和幫助；還要感謝山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供實(shí)驗(yàn)室及動物實(shí)驗(yàn)中心的幫助。

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