崔 智，李瑞生，李曉娟，胡 燕，戴廣海，白云峰

(1.解放軍總醫(yī)院腫瘤綜合治療科，北京 100853;2.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)保障中心，北京 100039)

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是由肝細(xì)胞或者膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，全世界每年死于肝癌的患者大約26萬人，其中我國占42.5%。由于藥物治療效果欠佳，因此深入闡明肝癌的致病機(jī)理對于開發(fā)新的藥物治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。磷脂酶 C epsilon(pnospholipase C epsilon，PLCε)為1998年日本神戶大學(xué)的片岡徹(Kataoka T)教授［1］在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，該研究組還發(fā)現(xiàn)PLCε是癌基因產(chǎn)物Ras及抑癌基因產(chǎn)物 Rap的新效應(yīng)蛋白［2］。2003年Kataoka實(shí)驗(yàn)室采用基因打靶法成功建立了 PLCε敲基因鼠，通過皮膚化學(xué)誘癌法(DMBA，TPA 二階段誘癌方案)發(fā)現(xiàn) PLCε－/－小鼠的乳頭瘤發(fā)生頻率明顯下降，并且它的惡性進(jìn)展也被明顯抑制，從而確立了PLCε在皮膚癌變過程中的重要作用［3］，Ikuta 等［4］進(jìn)一步證明了 TPA 介導(dǎo)PLCε的活化而誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致腫瘤的形成。本實(shí)驗(yàn)擬采用突變誘發(fā)劑二乙基亞硝胺和腫瘤增強(qiáng)劑苯巴比妥誘發(fā) PLCε敲基因型(PLC－/－)和野生型(PLC+/+)小鼠來建立肝臟腫瘤動物模型，以了解PLCε基因敲除鼠的抗癌特性，從而來分析其肝癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

PLCε基因敲除鼠采用基因打靶法做成，已對基因敲除鼠進(jìn)行了形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定，以確認(rèn)基因缺損鼠喪失PLC活性，由日本引進(jìn)到解放軍第302醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，隨機(jī)選取新生 PLCε－/－(敲基因型)和 PLCε+/+(野生型)雄性小鼠各80只，單鼠體質(zhì)量6～8 g，動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF級，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證【SYXK(軍)2007-010】。

1.2 化學(xué)致癌劑配制

DEN(淡黃色液體，Sigma公司提供，貨號 N-0258);PB(恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司提供25g/瓶，批號110927)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及肝癌誘導(dǎo)

將出生后6周小鼠剪尾取血提取DNA，用RTPCR法進(jìn)行基因型鑒定獲得 PLCε+/+(野生型)，PLCε+/－(雜合子)和 PLCε－/－(敲基因)等三種基因型［5］。選取 PLCε+/+與 PLCε－/－小鼠各 25 對入組，分別進(jìn)行野生型與野生型、敲基因型與敲基因型自交繁殖，出生后 12日齡時(shí)從 PLCε－/－型和PLCε+/+型中隨機(jī)選取雄性小鼠各80只，其中:40只 PLCε－/－鼠入實(shí)驗(yàn)組Ⅰ，40 只 PLCε－/－鼠入對照組Ⅰ，40只 PLCε+/+鼠入實(shí)驗(yàn)組Ⅱ，40只 PLCε+/+鼠入對照組Ⅱ。對照組Ⅰ、Ⅱ正常給予飼料及飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ給予腹腔注射 DEN10μg/(g·bw)［3］，注射后給予正常飼料及飲水，待4周齡后采用濃度為0.05%PB［3］飲水，一周后改為0.06%PB飲水。每天觀察試驗(yàn)鼠的精神、飲食、毛色、糞便等情況，24周后取肝臟。計(jì)算出小鼠的存活率和誘癌成功率，存活率 =每組存活的小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù)×100%，誘癌成功率=誘癌成功小鼠數(shù)/各組小鼠數(shù)×100%。

1.4 病理標(biāo)本的收集和處理

采取脫臼法分別處死實(shí)驗(yàn)組及對照組小鼠，打開腹腔，迅速取出肝臟稱重，觀察肝臟顏色、大小、質(zhì)地及有無癌變結(jié)節(jié)。取肉眼觀察到有病變的組織放入4%甲醛溶液中固定24～48 h，再用酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片后進(jìn)行 HE染色，最后拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的存活數(shù)及存活率

實(shí)驗(yàn)期間，由于致癌劑的毒性作用，實(shí)驗(yàn)組小鼠從第3周開始出現(xiàn)精神萎靡，活動和飲食水量減少以及背部出現(xiàn)脫毛等現(xiàn)象，從第5周開始野生型和敲基因型實(shí)驗(yàn)組分別出現(xiàn)死亡，至第24周時(shí)野生型實(shí)驗(yàn)組小鼠存活 30只，死亡 10只，存活率為75%，野生型對照組小鼠存活 40只，其存活率為100%;敲基因型實(shí)驗(yàn)組小鼠存活32只，死亡8只，存活率為80%，敲基因型對照組小鼠成活40只，成活率為100%。其具體情況見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟肉眼觀察

誘癌24周時(shí)，解剖后肉眼觀察，各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟體積和重量均增大，顏色黯淡，絕大部分表面可見灰白色結(jié)節(jié)，腫塊大體觀察:切面呈灰白色魚肉狀，無明顯壞死或出血改變，與周圍正常肝組織分界較清晰，其中野生型實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟及腹膜上可見多發(fā)小結(jié)節(jié)狀轉(zhuǎn)移灶(見圖1，彩插2)。敲基因型實(shí)驗(yàn)組小鼠絕大部分不能肉眼看到肝臟結(jié)節(jié)，但肝臟體積增大，少部分表面可見灰白色結(jié)節(jié)。而兩個(gè)對照組小鼠的肝臟均呈現(xiàn)光滑無病變(見圖2，彩插2)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活數(shù)及存活率分析Tab.1 Number of the mice survived in each experimental group and survival analysis

2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠病理分析及誘癌成功率

兩組實(shí)驗(yàn)組病理所見:瘤細(xì)胞呈實(shí)性巢狀，局灶見壞死，瘤細(xì)胞異型性明顯，胞漿豐富，嗜酸性，核圓形，核仁清楚，核分裂像多見。瘤細(xì)胞間可見裂隙樣血管，腫瘤與周圍正常肝組織分界較清楚，并可見畸形的瘤巨細(xì)胞，部分瘤細(xì)胞圍繞血管生長，局部見瘤細(xì)胞侵犯血管壁(見圖3和4，彩插2)。野生型實(shí)驗(yàn)組成活的30只小鼠病理分析提示有18只誘發(fā)肝癌成功，其誘癌成功率達(dá)60%;敲基因型實(shí)驗(yàn)組成活的32只小鼠病理分析提示有15只誘發(fā)肝癌成功，其誘癌成功率達(dá)46.9%。

3 討論

目前復(fù)制腫瘤誘發(fā)動物模型的誘發(fā)劑種類較多，但大多采用高劑量的致癌劑加促癌物混合短期使用或致癌劑的單獨(dú)長期使用的方法來研究腫瘤的形成［6，7］，其誘變是一個(gè)比較復(fù)雜的多階段作用過程，其促癌物可通過長期反復(fù)的累積作用促進(jìn)潛在的腫瘤細(xì)胞發(fā)生癌變。DEN具有較強(qiáng)的肝臟毒性作用，其作為致癌物與人原發(fā)性肝癌在病因?qū)W上存在著一定的相似性，其誘發(fā)的小鼠肝癌為肝細(xì)胞癌，與人的肝癌的發(fā)生過程也較為相似。由于其具有較高的成功率和良好的專一性，DEN誘導(dǎo)肝癌模型迄今仍然是應(yīng)用最為廣泛的肝癌模型。如壽旗揚(yáng)等［8］采用小劑量 DEN誘發(fā) C3H/HeN小鼠，成功地建立了肝癌小鼠模型。而侯敏等［9］還利用乙基亞硝脲(ENU)誘變劑也成功地建立了小鼠肺腺癌模型。苯巴比妥(PB)主要是對肝臟作為其特異性靶器官，它有可能抑制正常細(xì)胞因其他因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，甚至抑制潛在的癌變細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，使病灶中有基因損傷的細(xì)胞存活下來，從而促進(jìn)了腫瘤的形成［10－11］。實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞凋亡減少可認(rèn)為是苯巴比妥重要的促癌途徑之一，苯巴比妥可以通過促進(jìn)細(xì)胞增生和抑制細(xì)胞凋亡兩種途徑，來促進(jìn)癌前細(xì)胞增生灶的數(shù)量和密度，從而促進(jìn)腫瘤的形成。事實(shí)上，腫瘤的發(fā)生正是高細(xì)胞增殖率和相對較低的細(xì)胞凋亡率共同作用的結(jié)果［12］。

PLCε不僅具有 PLC典型的催化結(jié)構(gòu)域(X、Y)、C2結(jié)構(gòu)域同源序列，而且還有特異性的羧基端大鼠肉瘤(rat sarcoma，Ras)相關(guān)(ras association，RA)結(jié)構(gòu)域和氨基端 Ras鳥苷交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)結(jié)構(gòu)域，研究證明PLCε被小G蛋白激活，可通過對第二信使有直接反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白控制著Ras鳥苷三磷酸酶(GTPase)，因小G蛋白家族成員絕大部分都是癌基因編碼的蛋白，它們在細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)或激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，因此推測PLCε在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［13］。

本研究采用突變誘發(fā)劑(DEN)聯(lián)合腫瘤增強(qiáng)劑(PB)成功地誘導(dǎo)出小鼠肝癌動物模型，其天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的生化檢測值比正常PLCε小鼠檢測結(jié)果［14］偏高，說明在癌變過程中也會出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。而在誘癌過程中實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)死亡，而對照組沒有，這可能是由于腹腔注射時(shí)的感染、臟器的損傷以及個(gè)別小鼠對藥物DEN和PB敏感所造成的。結(jié)果顯示PLCε敲基因型實(shí)驗(yàn)組小鼠的成活率高于野生型實(shí)驗(yàn)組，誘癌成功率要低于野生型實(shí)驗(yàn)組，這可能是由于PLCε基因與肝臟腫瘤發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。該模型是在致癌因子作用下，通過自身細(xì)胞的突變、轉(zhuǎn)化和增殖形成的，這種模型在研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制、組織學(xué)和生物學(xué)特性以及腫瘤與宿主的相互關(guān)系等方面要比移植性肝癌模型更合適更有效［15］。這也為肝臟腫瘤的基因治療提供了一種新的思路和理論依據(jù)。

(本文圖 1，2，3，4 見彩插 2 。)

［1］Song C，Hu CD，Masago M，et al.Regulation of a novel human phospholipase C，PLCepsilon，through membrane targeting by Ras.J Biol Chem［J］.2001，276(4):2752 －2757.

［2］Song C，Satoh T，Edamatsu H，et al.Differential roles of Ras and Rap1 in growth factor-dependent activation of phospholipase C epsilon.Oncogene［J］.2002，21(53):8105 － 8113.

［3］Bai Y， Edamatsu H， Maeda S， etal.Crucialrole of phospholipase Cepsilon in chemicalcarcinogen-induced skin tumor development.Cancer Res［J］.2004，64(24):8808－8810.

［4］Shuzo Ikuta，Hironori Edamatsu，Tohru Kataoka，et al.Crucial Role of Phospholipase Cεin Skin Inflammation Induced by Tumor-Promoting Phorbol Ester.Cancer Research［J］.2008，68:64－72.

［5］崔智，李曉娟，白云峰，等.PLCε基因敲除小鼠微衛(wèi)星 DNA遺傳監(jiān)測分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(10):19－23.

［6］丁仕義，蔡金華.大鼠肝細(xì)胞癌模型的建立及 MR成像研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(6):643 － 645.

［7］張閩光，吳孟超，陳 漢，等.TNP-470二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌的作用［J］.腫瘤學(xué)雜志，2002，8(1):43－ 45.

［8］壽旗揚(yáng)，陳方明，趙泓舒，等.二乙基亞硝胺誘發(fā) C3H/HeN小鼠肝癌模型的研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36(5):543－546.

［9］侯敏，戴麗軍，譚小軍，等.小鼠肺腺癌模型的建立及腫瘤病理分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2012:20(4):75－79.

［10］Tetri S，Ruhanen M，Viitala P，et al.Lack of association between CYP2A5 induction and apoptosis in mouse primary hepatocytes［J］.Biochem Pharmacol，2002，63(3):429 － 435.

［11］Kinoshita A，Wanibuchi H，Imaoka S，et al.Formation of 8－h(huán)ydroxydeoxyguanosine and cell cycle arrest in the rat liver via generation of ox idative stress by phenobarbital:association with expression profiles of p21(WAF1/Cip1)，cyclin D1 and Ogg1［J］.Carcinogenesis，2002，23(2):341 － 349.

［12］冷言冰，龍冬梅，舒為群，等.苯巴比妥在大鼠肝癌模型中的促癌作用［J］.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2003，24(5):334 －337.

［13］姜泰茂，楊志軍，白云峰，等.誘發(fā) PLCε基因敲除小鼠膀胱癌發(fā)生過程中病變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(4):286 －288.

［14］李瑞生，李曉娟，戰(zhàn)大偉，等.PLCε基因敲除小鼠血液生理生化指標(biāo)分析［J］.實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)，2012，29(3):1 －4.

［15］金星林，千昌石，杜希臣，等.改良法建立大鼠原發(fā)性肝癌變模型與病理形態(tài)學(xué)研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，41(17):189.