王貴利，張連峰

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021)

1 簡介

實驗大鼠，又名挪威大鼠，起源于亞洲，在1700年左右傳播到歐洲和美洲。早在1850年之前就被應用于營養(yǎng)學實驗，是第一個馴養(yǎng)的用于醫(yī)學研究的哺乳動物［1］。然而，直到 1856年法國內科醫(yī)生 J.M.Philipeaux［2］才發(fā)表了第一篇利用白化大鼠進行研究的文章。1903年人們發(fā)現大鼠的毛色遺傳遵循孟德爾遺傳規(guī)律。同時，大鼠和小鼠的第一個近交系都誕生于1909年。在一百年間，大鼠在實驗動物中處于統(tǒng)治地位，被生理學家、心理學家和生物藥物研發(fā)者使用。迄今為止，大鼠已有700種不同的封閉群、近交系、突變系和同類系，成為人類疾病和生理特性研究的動物模型［1］。利用PubMed搜索過去50年的非綜述文獻，發(fā)現直到本世紀初，以大鼠為實驗材料的文獻仍多于小鼠。雖然現在小鼠成為更流行的動物模型，但對許多研究者，包括部分生理學家，行為學家和毒理學家而言，大鼠仍是首選。原因除大鼠體型較大，更適合體內成像、電生理、手術等操作外，還在于大鼠在生理、某些行為、代謝等方面更接近人類。所以大鼠是某些心腦血管疾病研究、毒理學研究、神經學和行為學研究理想的動物模型［3］。并且在部分疾病模型中，轉基因大鼠彌補了轉基因小鼠的局限性。例如大鼠具有更準確的炎癥疾?。?］和包括帕金森［5-7］、亨廷頓氏病［8，9］在內的神經系統(tǒng)疾病表型。轉基因亨廷頓氏病大鼠模型不僅具有比小鼠更典型的成人病理表型，而且更適合活體代謝和結構成像分析［8］。此外，在大鼠腦黑質中表達突觸核蛋白，可以造成多巴胺神經元的損失，這在小鼠中無法實現［6，7］。

表1 大鼠、小鼠和人類的主要生理數據比較Tab.1 Comparison of major physiological parameters between rat，mouse and human

綜上，由于大鼠的特點，在生理、代謝、神經系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及學習、認知、記憶和激勵某些行為研究，以及藥物安全評價等方面，具有比小鼠更好的表現。因此，大鼠在生命科學研究中的作用日趨重要。

雖然以大鼠制作人類疾病研究的動物模型有很多優(yōu)點，但是大鼠基因工程技術的缺乏嚴重阻礙了大鼠動物模型的發(fā)展。直到2008年，才建立了可用于基因打靶的大鼠胚胎干細胞［10-12］。最近，幾個科研小組建立了通過大鼠干細胞進行基因打靶獲的技術［13-16］。但是大鼠胚胎干細胞分化和生殖細胞傳代效率的低下限制了該技術的應用。隨著不依賴于胚胎干細胞的基因修飾技術，包括轉座子及逆轉座子，鋅指酶(zinc finger nucleases，ZFN)和類轉錄激活因子效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)等技術的不斷完善，大鼠基因工程成為實驗動物科學的熱點，并可以利用這些技術制作大鼠模型。并預測可能基于大鼠基因工程的進展，大鼠進一步發(fā)揮其對生物學研究巨大的促進作用，進而發(fā)展為“遺傳生理學”新學科和生命科學的前沿。本文對基因工程大鼠的研究進展作了總結。

2 轉基因大鼠及其資源

轉基因是建立大鼠疾病模型的主要方法，但在操作中該方法有以下不足:大鼠的超排卵受品系和個體影響較大，超排卵不易受精且胚胎易畸形，細胞質膜和核膜更厚更具有彈性，不易顯微注射，卵胞質易損傷，注射后卵細胞易裂解，因此轉基因大鼠的成功率低［17］。Rat Resource and Research Center收錄了約40種轉基因大鼠，包括 GFP、LacZ、Cre 等基因。

傳統(tǒng)方式的轉基因是將目的基因克隆至人工啟動子下進行表達，不足是由于克隆載體承載外源基因能力有限，一些重要的調節(jié)元件如增強子、抑制子無法克隆至載體中。第二，由于人工啟動子的局限性和插入位點的效應影響，目的基因可能無法精確地進行時空特異性表達。此外，由于使用的是cDNA，所以無法實現目的基因的可變剪切。人工細菌染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)介導的大鼠轉基因克服了上述缺陷［18-21］。它是建立在E.coli F致育因子上的大片段DNA插入克?。?2］，可以承載大至400 kb的外源DNA，包括哺乳動物的基因以及啟動子、增強子、抑制子、內含子，5’和3’非翻譯區(qū)等。同時由于插入片段極大，消除了插入位點的影響，并且可以模擬體內的可變剪切，以及基因的時空特異性表達。

3 轉座子技術介導的大鼠基因敲除

轉座子是能夠在基因組上跳躍或者復制后插入到新位點的基因片段。研究者研發(fā)了很多在哺乳動物細胞中具有活性的轉座子和逆轉座子系統(tǒng)，包括PiggyBac(PB)、Frog Prince、Sleeping Beauty(SB)等轉座子和LINE1(L1)逆轉座子［23-27］。SB經過不斷優(yōu)化，成為了嚙齒類動物模型中轉座子介導的基因操作的常用工具。SB轉座子由魚類的基因組中通過基因工程手段獲得，包括兩種組分。轉座子兩端為200～250 bp的反向重復序列(inverted repeats，IRs)，在IRs內部是轉座酶結合位點正向重復序列 (direct repeats，DRs);中間是目的基因或者報告基因。轉座酶由1600 bp的基因編碼，屬于Tc1/mariner轉座子家族。SB轉座子最初應用于大鼠的隨機飽和突變，隨后即可造成大鼠的插入突變［28］。該方法的流程是:首先分別獲得表達轉座酶和攜有轉座子序列的兩種轉基因大鼠，將兩種大鼠雜交，獲得雙轉大鼠。在該大鼠的生殖細胞中，轉座酶通過剪切-粘貼的方式，將一個或多個轉座子從原始插入位點切下并插入新位點。將雙轉大鼠和野生型大鼠再次雜交，獲得只攜有轉座子的F1代轉基因大鼠。由于轉座酶的分離，體內的轉座子即可固定。如果轉座子系統(tǒng)和基因捕獲系統(tǒng)結合，當轉座子插入到基因的編碼區(qū)時，插入到轉座子中的基因捕獲元件就破壞該基因的表達，造成基因敲除突變?；虿东@系統(tǒng)在轉座子系統(tǒng)的幫助下，在基因組中跳躍，可對基因組進行飽和突變。有研究者采用了另一種方式，將轉座子轉化入精原干細胞中，首先通過抗性和報告基因在細胞水平篩選獲得目的基因捕獲克隆，進而獲得具有目的表型的突變大鼠，從而提高轉座子介導的基因 突 變 效 率［29］。PhysGen Program forGenomic Applications(http://pga.mcw.edu)利用轉座子研制出91種轉座子介導的基因敲除大鼠。如將轉座酶克隆至組織特異性啟動之下，轉座酶在特定的組織表達，就會產生特定組織基因突變的大鼠。此外，在轉基因操作中，如有轉座酶的協(xié)助，單拷貝轉基因的效率會顯著提高［30］。

轉座子介導的突變的優(yōu)點如下:只需要將攜有轉座子序列和表達轉座酶的大鼠雜交，操作簡單。與基因打靶相比，轉座子介導的基因捕獲是隨機的，但一般說來，單個F1個體中，只有少量的轉座子插入，因此很容易的通過報告基因(例如eGFP，β-galactosidase或者tyrosinase)或者PCR來鑒定，并通過雜交來分離單插入位點。如在精原干細胞中進行該操作，可以在細胞中篩選。并且，利用精原干細胞進行轉座子突變的效率很高。如果生殖細胞傳代正常，將F1代雜合子雜交獲得純合的基因修飾動物只需要五個月。該方法的缺陷在于轉座子在基因組中的插入并不是完全隨機的，存在一定的“熱點”和“冷點”。這就造成了基因捕獲也不是完全隨機的［31］。所以，在某些染色體區(qū)域，突變的范圍和頻率具有一定的局限性。

4 鋅指酶介導的大鼠基因敲除

鋅指酶是人工設計的含有兩個功能結構域的蛋白核酸內切酶Fok I結構域和由重復的鋅指結構組成的DNA識別結構域。每一個鋅指結構可以特異地識別3個核酸，6個鋅指結構就可以特異地識別18個核酸，從而決定了識別位點的特異性。核酸內切酶Fok I必須形成二聚體才能夠將DNA雙鏈剪開，因此要在目的位點左右兩端都設計鋅指酶［32，33］。鋅指酶將DNA雙鏈剪開形成雙鏈缺口，修復該缺口有兩種方式:可能造成DNA缺失或者插入的易錯非同源末端連接［34］，該方式容易形成移碼突變，過早的形成終止密碼子，從而造成基因敲除［35］。鋅指酶基因敲除大鼠起始于2009年，將編碼鋅指酶的DNA質?；蛘適RNA進行原核顯微注射，表達的鋅指酶就可以造成基因的突變。將該受精卵移植入假孕母鼠體內，就會有突變的子代大鼠產生［36］。到目前為止，多個研究組通過該方法研發(fā)出了基因敲除大鼠［37-41］。另外一種修復方式為保守的同源修復，在常規(guī)狀態(tài)下，會將缺口恢復如初，如果人為的轉入兩端連有缺口兩端同源臂的外源基因，那么就會將該外源基因插入到缺口中，形成基因敲入［42］。

鋅指酶基因修飾具有以下優(yōu)點:第一，定向和高效［42］。第二，通過同源修復，可以精確地進行包括點突變和基因敲入在內的基因修飾。第三，在所有測試的品系中都能高效工作［36，38］。局限性在于鋅指酶識別的目標序列長度是一定的，所以某些基因包括一些小基因和同源性高的基因，不可以被敲除?？梢孕纬烧T導或條件性敲除的大片段基因無法通過鋅指酶技術敲入針對靶位點高效鋅指酶的設計仍具有一定挑戰(zhàn)性。此外，鋅指酶具有一定的潛在脫靶效應［43］，雖然在大鼠中還未發(fā)現。

5 TALENs介導的大鼠基因敲除

TALENs是由來自于植物病原菌黃單孢菌的類轉錄激活因子效應因子TALEs，和核酸內切酶Fok I的催化區(qū)域融合而成［44-53］。高度保守的33～35個氨基酸TALEs重復組件，決定了TALEs結合DNA的識別特異性。在 TALEs中，被稱為 repeat variable di-residues(RVD)的12和13位相鄰的兩個氨基酸，決定了識別的位點。天冬酰胺和異亮氨酸識別A，天冬氨酸和組氨酸識別C，天冬酰胺和甘氨酸酸識別T，兩個天冬酰胺識別 G［44，45］。TALENs性質與鋅指酶相似，識別特異的DNA序列，將其剪切形成雙鏈缺口，通過同源修復或者非同源末端連接修復該缺口，從而造成了基因插入或缺失［54-57］。TALENs作為一種新興基因修飾技術應 用 于 酵 母［50］，斑 馬 魚［58，59］，人 體 細 胞，癌 細胞［48，56，60，61］，干細胞［62］，基因敲除大鼠［63］。

TALENs和 ZFN相比，優(yōu)點有二個方面:一是TALENs的識別位點更廣泛，幾乎可以敲除所有的基因;第二是TALENs的剪切效率比ZFN高，在Tesson的研究中，使用TALENs陽性率為59%，而相應的使用鋅指酶方法的成功率為19%［63］。本試驗室的對比研究中，也證實TALENs的剪切效率比ZFN高。

6 胚胎干細胞介導的基因打靶

2008年，有研究者分離出可用于基因打靶的胚胎干細胞，傳代18代后40%的細胞仍保持正確核型。繼續(xù)傳代后細胞密度降低［64］。隨后使用不同于小鼠干細胞培養(yǎng)基的純化學成分，不含血清，添加GSK3、FGFRTK和MEK小分子抑制物的N2B27培養(yǎng)基，才建立并保持了具有生殖細胞分化能力的大鼠干細胞［10-12］?，F在已從 Wistar、Sprague-Dawley(SD)、dark agouti(DA)、Longe Evans(LE)、Brown Norway(BN)和SHR 大鼠中分離出胚胎干細胞［10，11，14，65，66］。同小鼠技術路線一樣，可以在大鼠干細胞水平進行基因打靶。DA、SD、Wisar大鼠胚胎干細胞的生殖細胞分化率極低［14］。至今只有DA大鼠的干細胞經過顯微注射后移植入F344大鼠可以傳代，而以SD大鼠為受體則無法成功［13，14，66］。

該方法的優(yōu)點為定向打靶，條件敲除。缺點是受品系影響較大，可以參與生殖細胞發(fā)育的胚胎干細胞資源受限，細胞特性、培養(yǎng)條件有待穩(wěn)定;嵌合體中供體和受體的細胞不易鑒定區(qū)分;另外該方法的生殖細胞分化效率遠遠低于小鼠［66］，所需時間長于TALENs和ZFN技術。

7 總結

由于大鼠在生理、某些行為、代謝等方面具有比小鼠更優(yōu)良的特點，成為生命科學和醫(yī)藥研究期待的動物模型。基因工程大鼠的研究成為實驗動物科學的熱點。目前適用于大鼠基因工程的技術各有優(yōu)缺點。TALENs和ZFN技術，目前只能實現系統(tǒng)敲除，而不易實現條件敲除，這對致死基因和特定組織的研究不利，有待于技術的進一步發(fā)展。大鼠胚胎干細胞基因打靶技術可以進行精確的條件性基因敲除，但是，大鼠胚胎干細胞的穩(wěn)定性尚有待提高。轉座子技術的應用，有可能發(fā)展為大規(guī)模條件敲除的優(yōu)勢技術，總之，大鼠基因修飾模型已經具有可行性，可以預見在不久的將來，大鼠將在人類疾病和生理研究中發(fā)揮重要的作用。

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