巨英超，謝 英，劉 超，吳建華，劉樹鋒

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2.河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)研究室，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，石家莊 050017)

斑馬魚作為一種新型的模式生物，正逐漸拓展和深入應(yīng)用到生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究中。盡管斑馬魚作為國(guó)際上應(yīng)用最廣的實(shí)驗(yàn)魚類，但其作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物尚未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。隨著我國(guó)實(shí)驗(yàn)斑馬魚應(yīng)用范圍的拓展和深入，斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)化研究顯得越來越重要［1－4］。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有了斑馬魚資源信息網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，可以為斑馬魚基因組及生物信息學(xué)分析提供參考依據(jù)［5］，有關(guān)斑馬魚的人工繁殖、生態(tài)、生理等方面也已有報(bào)道［6－7］，國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)就斑馬魚的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化工作開展了研究［8］，但是就飼養(yǎng)密度對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育與存活的影響方面則未見報(bào)道。本文將就此進(jìn)行探討，以期為實(shí)驗(yàn)室斑馬魚相關(guān)研究工作及斑馬魚的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化提供一些基礎(chǔ)資料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

AB品系斑馬魚引自北京大學(xué)生命科學(xué)研究院，飼養(yǎng)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心斑馬魚實(shí)驗(yàn)室自制的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，自動(dòng)控制光照，晝夜時(shí)間交替為14 h∶10 h。養(yǎng)殖系統(tǒng)中獨(dú)立飼養(yǎng)單元的容積為3 L，水溫(28.3 ±0.17)℃，pH 值(7.5±0.02)，電導(dǎo)率(1.07 ±0.06)ms/cm，NH4+－N ＜0.04 mg/L［9］。

1.2 方法

試驗(yàn)分為 5 個(gè)組，密度分別為 1、2、4、6、8Tail/L。孵化后的幼魚14 d之前飼養(yǎng)于1000 mL燒杯中，28℃水浴。4～10 d飼喂草履蟲(Paramoecium)，11 d開始加入豐年蝦(Artemia)進(jìn)行混合飼喂，并逐日增加豐年蝦的比例。14 d后按組別轉(zhuǎn)移到容量為3 L的獨(dú)立飼養(yǎng)單元內(nèi)，只投喂豐年蝦;每天8∶00、18∶00投食，飼喂量為每條魚 0.4 mL 用純凈水1∶3稀釋的豐年蝦［10］。20 d起每 10 d測(cè)量一次體長(zhǎng)和體重，90 d時(shí)處死魚只后分別測(cè)量體重、體長(zhǎng)、心臟重量、肝臟重量并計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)和臟器指數(shù)，比較各組的生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.3 參數(shù)計(jì)算與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

參數(shù)計(jì)算公式:

日增重(DWG)DWG=(W2－W1)/(t2－t1);

增重率(WGR)WGR=(W2－W1)/W1×100%;

增長(zhǎng)率(LGR)LGR=(L2－L1)/L1×100%;

所有公式中，W1、W2為時(shí)間 t1、t2時(shí)的體重(mg)，L1、L2為時(shí)間 t1、t2時(shí)的體長(zhǎng)(mm)。根據(jù)lietal(2000)的計(jì)算方法，成年魚臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/成年魚體重(mg)×100%。

所有數(shù)據(jù)使用 SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析。

表1 斑馬魚不同飼養(yǎng)密度的生長(zhǎng)參數(shù)(±s)Tab.1 The growth parameters of the zebrafish in different rearing density

表1 斑馬魚不同飼養(yǎng)密度的生長(zhǎng)參數(shù)(±s)Tab.1 The growth parameters of the zebrafish in different rearing density

初始體重/mg Initial weight 2.51±0.06a 2.36±0.07a 2.42±0.05a 2.41±0.06a 2.67±0.74a最終體重/mg Final weight 167.74±0.78a 162.63±0.65a 184.38±0.62a 108.29±0.98b 68.65±1.32c初始體長(zhǎng)/cm Initial length 0.43±0.01a 0.40±0.01a 0.41±0.001a 0.41±0.01a 0.42±0.01a最終體長(zhǎng)/cm Final length 2.65±0.16a 2.68±0.15a 2.76±0.09a 2.32±0.19b 1.86±0.22c DWG/mg×d－1Daily weight gain 2.36±0.02a 2.29±0.02a 2.60±0.02a 1.51±0.03b 0.946±0.03c WGR/%Weight gain rate 65.83±2.48a 67.91±3.18a 75.19±2.83a 43.93±4.60b 24.71±4.88c LGR/%Length gain rate 5.16±0.87a 5.70±0.97b 5.73±0.67b 4.66±0.95c 3.43±1.24d

表2 斑馬魚不同飼養(yǎng)密度的存活率Tab.2 The survival of the zebrafish in different rearing density

表3 斑馬魚不同飼養(yǎng)密度下90日齡的臟器指數(shù)(±s)Tab.3 The viscera index of zebrafish at 90 days of age in different breeding density

表3 斑馬魚不同飼養(yǎng)密度下90日齡的臟器指數(shù)(±s)Tab.3 The viscera index of zebrafish at 90 days of age in different breeding density

注:以上三表同一行中參數(shù)右上角處字母(a-d)相同代表差異性不顯著(P＞0.05)，不同則差異性極顯著(P＜0.01)。Note:The values with same letters mean no significant difference in a line above three charts(P ＞0.05)，and with different letters mean extremely difference(P ＜0.01).

臟器指數(shù)/%Viscera index 心臟 Heart 5.70±0.14a 5.74±0.21a 5.89±0.15a 4.87±0.19b 4.62±0.26b肝臟Liver 1.67±0.06a 1.58±0.08a 1.70±0.06a 0.96±0.09b 0.85±0.17b

2 結(jié)果

2.1 飼養(yǎng)密度與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系

通過表1可以看出，飼養(yǎng)密度在1至4Tail/L之間，其最終體重、體長(zhǎng)、DWG、GBW 略有變化，當(dāng)養(yǎng)殖密度為4Tail/L時(shí)達(dá)到最大值 ，但各組間差異不顯著。當(dāng)進(jìn)一步增加飼養(yǎng)密度時(shí)，各指標(biāo)反而下降，8Tail/L組的生長(zhǎng)速度、最終體重顯著低于其它組。從圖1(彩插2)的結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)，在6Tail/L和8Tail/L組，魚只的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)在后期都明顯表現(xiàn)放緩的跡象。日常飼養(yǎng)工作中觀察該組的魚只，發(fā)現(xiàn)體型也明顯較其他組瘦弱。

圖1 不同飼養(yǎng)密度下斑馬魚體重與體長(zhǎng)增長(zhǎng)曲線圖Tig.1 The curve graph of length and weight gain of the zebrafish in different rearing density

2.2 密度對(duì)存活率的影響

1Tail/L、4Tail/L 兩組未見死亡，2Tail/L、6Tail/L兩組只在個(gè)別平行組中出現(xiàn)了1、2尾死亡，而8Tail/L組中幾乎每個(gè)平行組都有2～5尾斑馬魚死亡，91.81%的存活率也明顯的低于其他組。

2.3 密度與成年魚臟器指數(shù)的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示高密度組的各臟器指數(shù)都顯著降低(表3)。解剖顯微鏡下觀察，1、2、4Tail/L組中斑馬魚的心臟和肝臟都比6Tail/L、8Tail/L組的要明顯，而且高密度組有很多斑馬魚很難找到肝臟，主要因?yàn)楦闻K顏色太淺無法判斷準(zhǔn)確。

3 討論

一般認(rèn)為，魚類的最終體重和日增重都隨著養(yǎng)殖密度的增大而顯著降低［11－13］，但有報(bào)道認(rèn)為，在適宜的飼養(yǎng)密度范圍內(nèi)，較高的飼養(yǎng)密度有利于其生長(zhǎng)。如Baker等對(duì)紅點(diǎn)鮭的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)飼養(yǎng)密度低于40～50 kg/m3時(shí)，紅點(diǎn)鮭的生長(zhǎng)率隨飼養(yǎng)密度增大而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但隨著飼養(yǎng)密度的進(jìn)一步增大，超過40～50 kg/m3時(shí)，魚類個(gè)體的活動(dòng)空間受到限制，繼而間接導(dǎo)致魚類個(gè)體的生長(zhǎng)受到限制，生長(zhǎng)率明顯下降。

在本試驗(yàn)中，4Tail/L以下密度組的斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育無明顯差異，4Tail/L密度組的相對(duì)生長(zhǎng)效果較其它組具有優(yōu)勢(shì)，成活率也高。密度過高則不利于斑馬魚的生長(zhǎng)發(fā)育，在高密度組普遍存在2～5尾較其他魚體型明顯小很多的魚，這在一些報(bào)道中也有提到［14－16］，究其原因可能是在高密度飼養(yǎng)條件采食競(jìng)爭(zhēng)激烈，少量魚只的采食量不能滿足其生長(zhǎng)發(fā)育的需要。而且過高的飼養(yǎng)密度也會(huì)引起飼養(yǎng)水體代謝產(chǎn)物的濃度加大，不利于魚只的生存?？紤]到飼養(yǎng)空間利用率等因素，建議將飼養(yǎng)密度確定為4Tail/L。

此前，The Zebrafish Book中曾指出斑馬魚的飼養(yǎng)密度不應(yīng)超過25Tail/45L即0.6Tail/L的密度，否則魚只的生長(zhǎng)發(fā)育將受到嚴(yán)重影響［10］。王天奇等也曾指出，成魚飼養(yǎng)密度不應(yīng)超過1Tail/L，幼魚不應(yīng)超過2Tail/L［8］。不同的研究結(jié)果可能是研究者采用不同的飼養(yǎng)繁育體系水處理效果的差異而致。本研究的結(jié)果反映了繁育設(shè)備中水環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚生長(zhǎng)發(fā)育的重要性，提示高效的飼養(yǎng)繁育體系及合理的密度有利于斑馬魚正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)不同飼養(yǎng)密度下斑馬魚的生長(zhǎng)性能指標(biāo)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)4Tail/L時(shí)斑馬魚有著較好的生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)密度過高不利于斑馬魚的生長(zhǎng)發(fā)育。斑馬魚作為一種新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其標(biāo)準(zhǔn)化工作是必然的趨勢(shì)，穩(wěn)定的環(huán)境、嚴(yán)格的管理須配合合理的飼養(yǎng)密度才能實(shí)現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于規(guī)模較小的實(shí)驗(yàn)室，在條件有限的情況下，合理的飼養(yǎng)密度對(duì)取得真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)極為重要。

(本文圖1，見彩插2)

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