石曉明吳勝春董軍杰唐雷楊永賓呂柏楠

1.河北省人民醫(yī)院普外二科，河北 石家莊 050051；

2.河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，河北 石家莊 050071

AQP-5基因沉默對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

石曉明1吳勝春1董軍杰2唐雷1楊永賓1呂柏楠1

1.河北省人民醫(yī)院普外二科，河北 石家莊 050051；

2.河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，河北 石家莊 050071

背景與目的：水通道蛋白-5(aquaporin 5，AQP-5)在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高，與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程有關(guān)。但AQP-5影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的具體影響尚不明確。本研究通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29內(nèi)源性AQP-5的表達(dá)，探討AQP-5對(duì)HT-29細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。方法：體外常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)AQP-5-siRNA轉(zhuǎn)染效率；采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染AQP-5 siRNA的HT-29細(xì)胞AKT、ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化形式及總蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：AQP-5-siRNA轉(zhuǎn)染使HT-29細(xì)胞AQP-5基因表達(dá)下調(diào)的效率達(dá)90%。MTT分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞增殖抑制率顯著增高(P＜0.05)，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NS-siRNA的陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞磷酸化的AKT、ERK和JNK蛋白磷酸化形式表達(dá)量與總蛋白表達(dá)量的改變兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞磷酸化p38與總的p38蛋白比值下降(P＜0.05)。結(jié)論：針對(duì)AQP-5的si-RNA具有促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的作用，該作用可能與抑制p38MAPK蛋白的磷酸化活化有關(guān)。

水通道蛋白5；結(jié)腸腫瘤；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

結(jié)腸癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)。p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，屬于絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員，參與細(xì)胞增殖、分化、死亡等多種生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)［1］。腫瘤細(xì)胞異常增殖需要更多水分子的快速轉(zhuǎn)運(yùn)，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類(lèi)廣泛存在于細(xì)胞膜上的、具有高選擇性的、特異轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的通道蛋白［2］。最近發(fā)現(xiàn)AQP-5在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高［3］，但AQP-5與結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及信號(hào)通路之間的關(guān)系尚不清楚。本研究選用針對(duì)AQP-5的siRNA，觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的通路蛋白表達(dá)的影響，探討AQP-5在結(jié)腸癌治療過(guò)程中的可能作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

噻唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)Sigma公司；DMEM/ F12培養(yǎng)液、胰蛋白酶，Gibco公司；AQP-5、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK (p-p38MAPK)及GAPDH抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；FASCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HT-29細(xì)胞：人結(jié)腸中分化腺癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中溫育。用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)溶液消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 AQP-5-siRNA轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組

［4］設(shè)計(jì)合成AQP-5特異性小干擾RNA(AQP-5-siRNA)序列，siRNA #1順義鏈：5’-AAAACTCTGCGAACACGGCCCCTGT CTC-3’，反義鏈：5’-AAGGCCGTGTTCGCA GAGTTCCTGTCTC-3’；siRNA #2順義鏈：5’-AAGAGCAGCCAGTGAAGTAGACCTGTCT C-3’，反義鏈：5’-AATCTACTTCACTGGCTGC TCCCTGTCTC-3’。無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA(nonspecific control siRNA，NS-siRNA)序列為：5’-GGUCUCACUCCCCAUAGAGTT-3’。轉(zhuǎn)染前24 h于6孔板中接種HT-29細(xì)胞，密度為4×105個(gè)/mL。轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM/F12清洗細(xì)胞，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)法，按照試劑說(shuō)明書(shū)用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋AQP-5-siRNA混合物或?qū)φ誑S-siRNA和相應(yīng)比例轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000，兩種稀釋液混合形成復(fù)合物后，將其轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及其他分子表達(dá)的情況。實(shí)驗(yàn)分組為：正常培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞(對(duì)照組)、轉(zhuǎn)染NS-siRNA的HT-29細(xì)胞(NS-siRNA組)和轉(zhuǎn)染AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞(AQP-5-siRNA組)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)溶液消化并接種于96孔板，接種密度為5×104個(gè)/mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，室溫振蕩15 min至結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm測(cè)吸光度A值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/ A對(duì)照組)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)溶液消化，4 ℃，500×g離心10 min后收集細(xì)胞，沉淀中加入預(yù)冷的70%乙醇1 mL，輕輕吹打，4 ℃固定過(guò)夜。4 ℃，500×g，離心10 min，去上清液，用1×PBS清洗2次。然后加入1 mL PI染液將細(xì)胞重懸，4 ℃避光染色30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)AKT、ERK、JNK、p38及磷酸化AKT、ERK、JNK和p38蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗滌3次，于細(xì)胞裂解液中重懸細(xì)胞，冰上裂解間斷渦旋30 min后，4 ℃，6 200×g離心10 min，將上清液收集到新的EP管中，用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白定量。各組取等量的細(xì)胞總蛋白依次經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、電轉(zhuǎn)移至PVDF膜、5%脫脂奶粉室溫封閉后，用稀釋后的各個(gè)目標(biāo)蛋白的一抗4 ℃溫育過(guò)夜，TTBS于室溫?fù)u床振搖漂洗3次后加入相應(yīng)二抗，室溫溫育2 h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，對(duì)條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用各蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 針對(duì)AQP-5的siRNA對(duì)HT-29細(xì)胞表達(dá)AQP-5的影響

參考文獻(xiàn)［3］人工合成AQP-5小干擾RNA(AQP-5-siRNA)轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染NS-siRNA的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。Western blot結(jié)果顯示，NS-siRNA組細(xì)胞中AQP-5高表達(dá)，而AQP-5-siRNA組HT-29細(xì)胞AQP-5的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，其下降幅度達(dá)90%，表明本研究所用的AQP-5-siRNA能高效抑制HT-29細(xì)胞中AQP-5的表達(dá)。NS-siRNA組與對(duì)照組相比，AQP-5的表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

2.2 針對(duì)AQP-5的siRNA對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染AQP-5-siRNA和NS-siRNA的HT-29細(xì)胞增殖活力改變，與NS-siRNA組相比，AQP-5-siRNA組的HT-29細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P＜0.05)，提示抑制AQP-5的表達(dá)可抑制HT-29細(xì)胞增殖。NS-siRNA組與對(duì)照組相比，增殖抑制率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表 1 HT-29細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率的變化Tab. 1 Change of growth inhibition rate and apoptosis rate in HT-29 cells

圖 1 各組AQP-5蛋白表達(dá)的變化Fig. 1 Expression of AQP-5 in colon cancer cells

2.3 針對(duì)AQP-5的siRNA對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞凋亡率的改變。與NS-siRNA組相比，AQP-5-siRNA組的HT-29細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)，提示抑制AQP-5的表達(dá)可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。NS-siRNA組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1、圖2)。

圖 2 各組細(xì)胞凋亡率的變化Fig. 2 Change of the apoptosis rate in HT-29 cells

2.4 針對(duì)AQP-5的siRNA對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞磷酸化的AKT、ERK、JNK和p38蛋白磷酸化形式表達(dá)量與總蛋白表達(dá)量的改變，結(jié)果顯示，與NS-siRNA組相比，AQP-5-siRNA組的HT-29細(xì)胞磷酸化的AKT、ERK和JNK蛋白磷酸化形式表達(dá)量與總蛋白表達(dá)量的改變兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，AQP-5-siRNA組的HT-29細(xì)胞磷酸化p38與總的p38蛋白表達(dá)下降，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，NS-siRNA組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明抑制內(nèi)源性AQP-5表達(dá)抑制了p38通路(圖3、4)。

圖 3 各組AKT、ERK、JNK、p38及磷酸化蛋白表達(dá)的變化Fig. 3 Expression of AKT, ERK, JNK, p38 and phosphorylation protein in every group

圖 4 各組AKT、ERK、JNK、p38及磷酸化蛋白的表達(dá)Fig. 4 Expression of AKT, ERK, JNK, p38 and phosphorylation protein in every group

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展是涉及多基因、多信號(hào)、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，在致癌因素的不斷刺激下，相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，主要表現(xiàn)為通路中關(guān)鍵效應(yīng)分子活性發(fā)生改變，從而引起下游基因的表達(dá)失調(diào)，最終引起腸上皮細(xì)胞永生化，具有無(wú)限增殖、逃避生理性凋亡點(diǎn)的監(jiān)控、侵襲性等特點(diǎn)。因此，通過(guò)對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控改變腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡能力是治療結(jié)腸癌的一種新途徑。

AQPs是近年發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于人體多種組織的跨膜蛋白，主要功能為選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水進(jìn)出細(xì)胞［2］，許多研究表明，AQPs參與人體多種生理和病理過(guò)程，最近的研究發(fā)現(xiàn)AQPs與人類(lèi)許多腫瘤關(guān)系密切［5-6］。其中AQP-5與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究表明，與正常組織相比，AQP-5在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)量與結(jié)腸癌分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)［7-8］。提示AQP-5在人結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中可能起重要作用。因此，揭示AQP-5在人結(jié)腸癌發(fā)展中的作用機(jī)制對(duì)結(jié)腸癌靶向性治療意義重大。本研究主要觀察抑制AQP-5的表達(dá)對(duì)HT-29細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中AQP-5表達(dá)水平較高，轉(zhuǎn)染AQP-5-siRNA后表達(dá)明顯減弱，與轉(zhuǎn)染NS-siRNA的陰性對(duì)照組相比，其下降幅度可達(dá)90%，表明AQP-5-siRNA能有效抑制內(nèi)源性AQP-5的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察了抑制AQP-5表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響。MTT分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞增殖抑制率顯著增加。流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞凋亡率顯著增加。以上結(jié)果提示，抑制AQP-5具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖的作用。

MAPK是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為真核細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)系統(tǒng)，可將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)引起細(xì)胞內(nèi)基本生理過(guò)程的反應(yīng)［9］。已經(jīng)鑒定出真核細(xì)胞中存在3條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別是ERK通路、JNK/ SPAK通路、p38 MAPK通路［10-11］。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路也是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的一條重要信號(hào)通路，Akt是此通路的關(guān)鍵分子之一［12］。這些信號(hào)分子與結(jié)腸癌Dukes 分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因而，許多藥物通過(guò)作用于這些通路發(fā)揮抑制結(jié)腸癌的作用。如Park等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，視黃醇可通過(guò)抑制PI3K 的活性誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 和SW620 的凋亡；卡馬拉素則可通過(guò)ERK和 p38通路誘導(dǎo)HT29細(xì)胞的凋亡［14］；P38MAPK 抑制劑則可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU 抗有絲分裂效應(yīng)的敏感性［15］?？梢?jiàn)，藥物可以作用于一條或多條通路發(fā)揮抗腫瘤的作用。為了明確抑制AQP-5通過(guò)哪條信號(hào)通路對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用，檢測(cè)了上述與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的幾條信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了AQP-5-siRNA的HT-29細(xì)胞磷酸化的AKT、ERK和JNK蛋白磷酸化形式表達(dá)量與總蛋白表達(dá)量的改變兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p38蛋白磷酸化形式表達(dá)量與總蛋白表達(dá)量的比例明顯下降，這表明抑制內(nèi)源性AQP-5表達(dá)可能通過(guò)抑制p38通路促進(jìn)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)。

已有研究已經(jīng)證明，p38 MAPK信號(hào)通路不僅在細(xì)胞增殖、分化、死亡及細(xì)胞間功能同步等多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，而且與炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控關(guān)系密切。因此，p38 MAPK被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的紐帶［16-17］。P38MAPK信號(hào)通路有4個(gè)基因編碼P38MAPK，分別是MAPK14 (編碼P38α)、MAPK11(編碼P38β)、MAPK12(編碼P38γ)和MAPK13(編碼P38δ)，大多數(shù)文獻(xiàn)中P38MAPK是指P38α。本研究?jī)H檢測(cè)了幾個(gè)通路的個(gè)別分子，通路的其他分子及下游分子的表達(dá)仍需進(jìn)一步深入分析。如P38能通過(guò)兩條途徑影響細(xì)胞存活，其一是調(diào)節(jié)自吞噬，其二是激活/失活糖原合成酶激酶3β(GSK3β)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子β-catenin蓄積［18］，這些通路中那些環(huán)節(jié)受AQP-5影響也需要進(jìn)一步證明。本研究雖僅利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AQP-5對(duì)p38 MAPK途徑的作用，其具體作用機(jī)制需結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)深入研究，但相信隨著研究的不斷深入，AQP-5會(huì)成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。

［參 考 文 獻(xiàn)］

［1］ LAWRENCE M C, JIVAN A, SHAO C, et al. The roles of MAPKs in disease［J］. Cell Res, 2008, 18(4): 436-442.

［2］ MAQNI F, SARTO C, TICOZZI D, et al. Proteomic knowledge of human aquaporins［J］. Proteomics, 2006, 6 (20): 5637-5649.

［3］ KANG S K, CHAE Y K, WOO J, et al. Role of human aquaporin 5 in colorectal carcinogenesis［J］. Am J Pathol, 2008, 173(2):518-525.

［4］ WOO J, LEE J, CHAE Y K, et al. Overexpression of AQP5, a putative oncogene, promotes cell growth and transformation［J］. Cancer Lett, 2008, 264 (1): 54-62.

李金枝的話(huà)把我弄糊涂了，我趕緊順著李金枝手指的方向看去。我腦袋里嗡了一下。即使沒(méi)戴眼鏡，我也知道自己是光著身子的。為了確認(rèn)事實(shí)，我又用手摸了摸自己。壞了，真壞了，不僅光著身子，而且光得非常徹底，真正的一絲不掛。

［5］ JUNG H J, PARK J Y, JEON H S, et al. Aquaporin-5: a marker protein for proliferation and migration of human breast cancer cells［J］. PLoS One, 2011, 6 (12): e28492.

［6］ ISHIMOTO S, WADA K, USAMI Y, et al. Differential expression of aquaporin 5 and aquaporin 3 in squamous cell carcinoma and adenoid cystic carcinoma［J］. Int J Oncol, 2012, 41 (1): 67-75.

［7］ 張洪志, 周士福, 康厚純, 等. 水通道蛋白5在人大腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］. 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2009, 29 (5): 945-947.

［8］ 肖廣發(fā), 湯恢煥, 李宜雄. AQP-1和AQP-5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2012, 28 (2): 186-187.

［9］ RUBY J, REHANI K, MARTIN M. Treponema denticola activates mitogen-activated protein kinase signal pathways through Toll-like receptor 2［J］. Infect I mmun, 2007, 75 (12): 5763-5768.

［10］ ZHANG W, LIU H T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells［J］. Cell Res, 2002, 12 (1): 9-18.

［11］ 楊柳松, 胡錦, 周良輔, 等. 酪氨酸激酶受體通路相關(guān)基因在原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其意義［J］. 中國(guó)癌癥雜志, 2008, 18(4): 254-257.

［12］ HAMADA K, SASAKI T, KONI P A, et al. The PTEN/PI3K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis［J］. Genes Dev, 2005, 19 (17): 2054-2065.

［13］ PARK E Y, WILDER E T, CHIPUK J E, et al. Retinol decreases hosphatidylinositol 3-kinase activity in colon cancer cells［J］. Mol Carcinog, 2008, 47 (4): 264-274.

［14］ LIM J H, WOO S M, MIN K J, et al. Rottlerin induces apoptosis of HT29 colon carcinoma cells through NAG-1 upregulation via an ERK and p38 MAPK-dependent and PKC δ-independent mechanism［J］. Chem Biol Interact, 2012, 197 (1): 1-7.

［15］ VAIDYA A A, SHARMA M B, KALE V P. Suppression of p38-stress kinase sensitizes quiescent leukemic cells to antimitotic drugs by inducing proliferative responses in them［J］. Cancer Biol Ther, 2008, 7 (8): 1232-1240.

［16］ ALISI A, SPAZIANI A, ANTICOLI S, et al. PKR is a novel functional direct player that coordinates skeletal muscle differentiation via p38 MAPK/AKT pathways［J］. Cell Signal, 2008, 20 (3): 534-542.

［17］ MARKOVIC D, PUNN A, LEHNERT H, et al. Intracellular mechanisms regulating corticotropin-releasing hormone receptor-2beta endocytosis and interaction with extracellularly regulated kinase 1/2 and p38 mitogen-activated protein kinase signaling cascades［J］. Mol Endocrinol, 2008, 22 (3): 689-706.

［18］ THORNTON T M, PEDRAZA-ALVA G, DENG B, et al. Phosphorylation by p38 MAPK as an alternative pathway for GSK3beta inactivation［J］. Science, 2008, 320 (5876): 667-670.

《抗癌》雜志2013年征訂啟事

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Effect of AQP-5-siRNA on the signaling pathway of human colon cancer HT-29 cells

SHI Xiao-ming, WU Sheng-chun, DONG Jun-jie, TANG Lei, YANG Yong-bin, LV Bo-nan (1.Department of General Surgery, Hebei General Hospital, Shijiazhuang Hebei 050051, China; 2. Medical Information Institute of Hebei Province, Shijiazhuang Hebei 050071, China)

LV Bo-nan E-mail: shixm99@163.com

Background and purpose: Aquaporin 5 (AQP-5) was overexpressed in colon cancer tissues, and AQP-5 was related to occurrence, progress of colon cancer. But the relationship between AQP-5, signaling pathway in colon cancer cells is still not clear. The purpose of this study was to investigate the effects of AQP-5 on the signaling pathway of human colon cancer HT-29 cells by inhibiting the expression of endogenous AQP-5 in colon cancer cell line HT-29 via AQP-5-siRNA transfection. Methods: Human colon cancer HT-29 cells were cultured in vitro and the cells in logarithm growth period were used. RNA interference (siRNA) technology was used to inhibit the expression of endogenous AQP-5 and Western blot was used to detect the inhibition efficiency of AQP-5-siRNA in HT-29 cells. MTT assay were used to detect the cell growth inhibition rate; Flow cytometry (FCM) was used to measure the cell apoptosis rate; To observe the effects of AQP-5-siRNA transfection on AKT, ERK, JNK and P38 pathway of HT-29 cells, the levels of the expression of AKT, ERK, JNK and P38 phosphorylation protein and total protein were measured by Western blot. Results: The results of Western blot showed that AQP-5 expression was suppressed by over 90% in HT-29 cells after AQP-5-siRNA transfection. MTT showed that the proliferation inhibition rate was increased significantly in HT-29 cells after AQP-5-siRNA transfection rather than NS-siRNA transfection (P＜0.05); FCM analysis showed that AQP-5-siRNA transfection induced HT-29 cell apoptosis (P＜0.05). Western blot showed that compared with NS-siRNA negative control group, AQP-5-siRNA transfection decreased the rates of p-p38 and p38. However, the level of the expression of AKT, ERK, JNK phosphorylation protein was not different between AQP-5-siRNA transfection group and NS-siRNA negative control group (P＞0.05). Conclusion: The RNA interference (siRNA) technology targeting to AQP-5 inhibited the expression of endogenous AQP-5 in HT-29 cells, inhibited the cell proliferation, and induced the cell apoptosis, and the effect may be related with its decreasing the rate of p-p38 and p38.

Aquaporin 5; Colonic neoplasms; Signaling pathway

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.007

R735.3+5

：A

：1007-3639(2013)04-0279-06

2012-10-10

2013-02-10）

呂柏楠 E-mail:shixm99@163.com