南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨一科，江西 南昌，330006

骨肉瘤miR-96的表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡

吳德明 劉翔 江川 戴閩

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨一科，江西 南昌，330006

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，其主要通過(guò)與靶mRNA作用抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯。miR-96是在多類(lèi)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的小RNA分子。本研究旨在檢測(cè)miR-96在骨肉瘤組織中的表達(dá)，并研究其在骨肉瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及凋亡中的意義。方法：運(yùn)用TagMan MGB探針?lè)z測(cè)40例骨肉瘤組織及對(duì)應(yīng)的骨組織中miR-96的表達(dá)；應(yīng)用反義技術(shù)降低骨肉瘤細(xì)胞(U2-OS和MG-63)中miR-96的表達(dá)；采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖的改變；應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡情況。結(jié)果：在40例骨肉瘤組織中，62.5%(25/40)的骨肉瘤組織miR-96表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)骨組織(P＜0.05)；反義miR-96轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63后，miR-96的表達(dá)明顯降低，U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，其生長(zhǎng)主要停滯在G0/G1期，而S期和G2/M期細(xì)胞的比例下降。另外，降低miR-96的表達(dá)，U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞早期凋亡明顯增加。結(jié)論：miR-96在骨肉瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，降低其表達(dá)能明顯抑制U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡增加，miR-96可能成為骨肉瘤基因表達(dá)調(diào)控的新靶點(diǎn)。

骨肉瘤；miR-96；反義單核苷酸；腫瘤抑制

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，約占骨惡性腫瘤的33%。它來(lái)源于有成骨潛能的間葉細(xì)胞，由惡性增殖的肉瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生腫瘤性骨樣組織或不成熟骨，也稱(chēng)為成骨肉瘤，其惡性程度極高，可嚴(yán)重?fù)p害勞動(dòng)生產(chǎn)力及危及患者生命，因此早期診斷及早期治療具有特別重要的意義［1］。

微小RNA 分子(miRNA)是長(zhǎng)度約為21個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，可以在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成，參與了細(xì)胞生物活動(dòng)調(diào)控的多個(gè)環(huán)節(jié)。另外，多數(shù)miRNA具有高度時(shí)序性、保守性和細(xì)胞組織特異性，同時(shí)受到發(fā)育和空間的調(diào)控，從而參與細(xì)胞的增殖、分化和死亡過(guò)程［2］。正常組織中某種或某些miRNA的表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)許多發(fā)揮重要作用的瘤基因或抑瘤基因受到異常調(diào)控而導(dǎo)致表達(dá)失常，從而使腫瘤發(fā)生。在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中，miRNAs扮演著“癌基因”和(或)“抑癌基因”的雙重角色［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-96在胱膀癌、乳腺癌、肺癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)［4-7］，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究擬采用TagMan MGB探針?lè)z測(cè)miR-96在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，同時(shí)用反義技術(shù)降低骨肉瘤細(xì)胞miR-96的表達(dá)，觀察骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期和凋亡情況，以便為骨肉瘤早期診治提供新的理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

收集2008年9月—2012年5月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院矯形外科40例骨肉瘤及對(duì)應(yīng)骨組織手術(shù)標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，其中男性27例，女性13例，年齡11～47歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。

1.2 試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、TaqMan miRNA分析試劑盒(美國(guó)ABI公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)；反義miR-96寡核苷酸(AMO-miR-96)(美國(guó)Invitrogen公司)；人骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS和MG-63(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀7500(美國(guó)ABI公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 TagMan MGB探針?lè)z測(cè)miR-96的表達(dá)

采用TRIzol試劑提取骨肉瘤及對(duì)應(yīng)骨組織中總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，-80 ℃保存待用，用TaqMan miRNA分析試劑盒檢測(cè)miR-96的表達(dá)。首先取2 μg總RNA為反應(yīng)模板，與3 μL逆轉(zhuǎn)錄酶相互混合，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，收集cDNA，將其稀釋150倍，然后取2 μLTaq Man引物與1 μL 稀釋的cDNA相混合，20 μL反應(yīng)體系：95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)miRNA表達(dá)用Ct值精確計(jì)算，以U6 snRNA作為內(nèi)參。

1.3.2 反義miR-96單核苷酸序列設(shè)計(jì)

依據(jù)miRBase(http://www.sanger.ac.uk/ software/Rfam/miRna)所提供的miRNA測(cè)序序列，獲取人miR-96的基因序列，并設(shè)計(jì)其反義寡核苷酸序列，同時(shí)運(yùn)用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序以排除其他的同源序列。另外，我們同時(shí)設(shè)計(jì)一條隨機(jī)對(duì)照序列，miR-96順義鏈：5’-AGCACAUUUUUGCUUGUGUCU-3’，miR-96反義鏈：5’-AGACACAAGCAAA AATGTGCT-3’。隨機(jī)序列順義鏈：5’-UCCUCUGAACGUGGCACGUUT-3’；反義鏈：5’-AGCUCACTCGUCCGCAGTATT -3’，送Invitrogen公司合成，PAGE純化，全硫代修飾。

1.3.3 細(xì)胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃條件下培養(yǎng)。嚴(yán)格遵照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作程序進(jìn)行轉(zhuǎn)染，反義miR-96寡核苷酸終濃度分別為：50、100、150、200 nmol/L，本研究前期初步篩選出最佳終干擾濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72 h，初步篩出最佳作用時(shí)間為48 h。將熒光對(duì)照的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后放置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察， 上述操作重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染效率為(87.5±6.0)%。

1.3.4 轉(zhuǎn)染反義miR-96單核苷酸后對(duì)miR-96表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染反義miR-96單核苷酸48 h后，提取總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定cDNA濃度，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、隨機(jī)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染PBS組。運(yùn)用TaqMan miRNA分析試劑盒檢測(cè)miR-96的表達(dá)(具體條件同1.3.1)。

1.3.5 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖

收集U2-OS和MG-63細(xì)胞，將各組細(xì)胞懸液在離心管內(nèi)反復(fù)充分打勻，接種于96孔培養(yǎng)板(6×103/孔)，24 h后換液。實(shí)驗(yàn)分組同1.3.4，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后1～4 d每孔加入濃度為5 mg/mL的 MTT試劑20 μL，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃條件下繼續(xù)溫育4 h。 用移液器吸取各孔上清液， 加入DMSO 150 μL/孔，在室溫條件下置水平搖床搖10 min以充分完全溶解MTT結(jié)晶。測(cè)定各孔吸光值(波長(zhǎng)490 nm)。每組重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(A490實(shí)驗(yàn)組-A490對(duì)照組)/A490對(duì)照組×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化情況

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.4。細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染反義miR-96單核苷酸48 h后收集細(xì)胞，PBS漂洗2次，離心后棄上清液，加入PBS重懸細(xì)胞，加-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇并振蕩充分混合，4 ℃固定1 h，離心后棄冰乙醇，PBS漂洗1遍，棄上清液；加入碘化吡啶(濃度為50 μg/mL PI)和無(wú)DNA酶污染的RNA酶PBS染色液(濃度為100 μg/mL)，4 ℃避光靜置1 h，上機(jī)檢測(cè)。每組重復(fù)3次。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞早期凋亡

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.4，細(xì)胞接種6孔板，轉(zhuǎn)染反義miR-96寡核苷酸。48 h后收集細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次， 離心后棄上清液。應(yīng)用Annexin V-FITC早期凋亡試劑盒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤組織miR-96的表達(dá)情況

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)40例骨肉瘤及對(duì)應(yīng)骨組織miR-96的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)62.5%(25/40)的骨肉瘤組織miR-96表達(dá)明顯高于相對(duì)應(yīng)的骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)；另外37.5%(15/40)的骨肉瘤組織miR-96的表達(dá)與相對(duì)應(yīng)的骨組織的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)骨肉瘤及骨組織miR-96的表達(dá)Fig. 1 Analysis the expression level of miR-96 in osteosarcoma and their adjacent nontumorous tissues using quantitative PCR

2.2 AMO-miR-96轉(zhuǎn)染后miR-96表達(dá)的變化

利用反義核苷酸技術(shù)，將反義miR-96寡核苷酸(濃度為100 nmol/L)轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63中48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-96的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，而空白對(duì)照組、隨機(jī)對(duì)照組及PBS組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖 2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMO-miR-96轉(zhuǎn)染后miR-96表達(dá)Fig. 2 Analysis the expression of miR-96 in AMO-miR-96 transfected osteosarcoma cells using quantitative PCR

2.3 AMO-miR-96作用后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

轉(zhuǎn)染AMO-miR-96的骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組(P＜0.05)，而空白對(duì)照組、隨機(jī)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染PBS組間骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異(P＞0.05，圖3)。

圖 3 AMO-miR-96作用后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig. 3 The osteosarcoma cells growth was significantly inhibited in AMO-miR-96 transfected osteosarcoma cells

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后骨肉瘤細(xì)胞周期變化情況

轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后的骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63通過(guò)流式細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后U2-OS和MG-63細(xì)胞阻滯于G0/G1期，而S期和G2/M期明顯降低。數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組、隨機(jī)對(duì)照組及PBS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而空白對(duì)照組、隨機(jī)對(duì)照組及PBS組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，表1、2)。

表 1 AMO-miR-96轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞降低miR-96表達(dá)后細(xì)胞周期變化Tab. 1 The changes of cell cycle after AMO-miR-96 transfected U2-OS cells %

表 2 AMO-miR-96轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞降低miR-96表達(dá)后細(xì)胞周期變化Tab. 2 The changes of cell cycle after AMO-miR-96 transfected MG-63 cells

2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況

骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后，U2-OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染AMO-miR-96組(22.2%)較空白對(duì)照組(3.64%)、隨機(jī)對(duì)照組(4.36%)、轉(zhuǎn)染PBS組(5.14%)早期凋亡明顯增加(P＜0.05)，MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染AMO-miR-96組(16.91%)較空白對(duì)照組(3.59%)、隨機(jī)對(duì)照組(4.21%)、轉(zhuǎn)染PBS組(4.36%)早期凋亡也明顯增加(P＜0.05)；而U2-OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染AMO-miR-96組(7.53%)、空白對(duì)照組(5.12%)、隨機(jī)對(duì)照組(4.40%)、轉(zhuǎn)染PBS組(6.40%)之間晚期凋亡無(wú)明顯改變；MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染AMO-miR-96組(7.47%)、空白對(duì)照組(6.34%)、隨機(jī)對(duì)照組(8.19%)、轉(zhuǎn)染PBS組(10.13%)之間晚期凋亡也未見(jiàn)明顯變化(圖4)。

圖 4 流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況Fig. 4 Flow cytometric analysis the osteosarcoma cells apoptosis after AMO-miR-96 transfected osteosarcoma cells

3 討 論

miRNAs是一類(lèi)新的基因調(diào)控因子，在控制細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、血管形成、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用［3,8］。miRNA通過(guò)與靶mRNA的3’非編碼區(qū)近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。隨著越來(lái)越多的miRNA被鑒定和深入研究，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與惡性腫瘤關(guān)系密切，大約有調(diào)控miRNAs編碼基因位的52%位于腫瘤相關(guān)染色體區(qū)域［9-10］。有研究者認(rèn)為miRNA實(shí)際上可作為癌基因或者抑癌基因而發(fā)揮作用。因此miRNAs可能成為診斷腫瘤的新的分子標(biāo)志和判斷腫瘤治療及預(yù)后的分子靶點(diǎn)，而且miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，更有助于惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，其必將具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［11］。

骨肉瘤是起源于成骨組織的一種原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于青少年長(zhǎng)管狀骨的干端，惡性程度高，預(yù)后差。雖然放化療及手術(shù)治療的水平在逐漸提高，但仍約有50%的患者治療失敗，原因就在于腫瘤的早期轉(zhuǎn)移以及耐藥性的出現(xiàn)［1,12］。因此，急需找到新的腫瘤標(biāo)志物來(lái)進(jìn)一步提高骨肉瘤的早期診療效果。近年隨著miRNAs研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)大量異常表達(dá)的miRNAs通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此大規(guī)模的篩選腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中異常表達(dá)的miRNAs將為人們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)腫瘤的生物學(xué)特性發(fā)揮重要作用，也為骨肉瘤的早期診治提供了新的希望。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-96在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)［4-7］。此外，Chen等［13］研究發(fā)現(xiàn)，降低miR-96的表達(dá)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。但miR-96在骨肉瘤中的表達(dá)及作用目前尚不清楚。

我們首先通過(guò)TagMan MGB探針?lè)ǘ糠治?0例骨肉瘤及對(duì)應(yīng)骨組織中miR-96的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)62.5%(25/40)的骨肉瘤組織miR-96表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。與miR-96在胱膀癌、乳腺癌等其他惡性腫瘤中的表達(dá)基本相符［4-7］。另外，Krützfeldt等［14］針對(duì)miRNA192的反義寡核苷酸能夠明顯抑制小鼠不同組織中相對(duì)應(yīng)microRNAs的表達(dá)，這表明針對(duì)miRNAs設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸能夠有效抑制microRNAs的表達(dá)，隨后本研究也用反義核苷酸技術(shù)成功降低骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63內(nèi)的miR-96表達(dá)，并成功篩選出其最佳作用濃度和時(shí)間。眾所周知，細(xì)胞的增殖過(guò)程是通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)完成的，惡性腫瘤的有序增殖取決于細(xì)胞周期的精確調(diào)控，因而采用多種手段、多種途徑干擾或阻斷腫瘤細(xì)胞的周期活動(dòng)可以達(dá)到有效抑制腫瘤增殖的目的。因此我們轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L的AMO-miR-96到U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞48 h后，應(yīng)用熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-96表達(dá)抑制率達(dá)76%，同時(shí)也運(yùn)用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。最后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染AMO-miR-96后的骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期各期DNA的含量及細(xì)胞早期凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾miR-96基因表達(dá)后，兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期主要停滯于G0/G1期，而S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量的比例明顯降低，并且兩組細(xì)胞的早期凋亡數(shù)量也明顯增加。

綜上所述，miR-96在調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用，其很可能成為一個(gè)骨肉瘤新的癌前標(biāo)記物，為骨肉瘤臨床基因治療提供新的靶點(diǎn)。但其具體的作用機(jī)制有待于我們進(jìn)一步深入研究。

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《中國(guó)癌癥雜志》2013年征訂啟事

《中國(guó)癌癥雜志》是由國(guó)家教育部主管、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院主辦的全國(guó)性腫瘤學(xué)術(shù)期刊，讀者對(duì)象為從事腫瘤基礎(chǔ)、臨床防治研究的中高級(jí)工作者。主要報(bào)道內(nèi)容：國(guó)內(nèi)外研究前沿的快速報(bào)道、專(zhuān)家述評(píng)、腫瘤臨床研究、基礎(chǔ)研究、文獻(xiàn)綜述、學(xué)術(shù)討論、臨床病理討論、病例報(bào)道、講座和簡(jiǎn)訊等?！吨袊?guó)癌癥雜志》已入選中文核心期刊、中國(guó)科技核心期刊及全國(guó)腫瘤類(lèi)核心期刊，并為中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊，先后被“中國(guó)期刊網(wǎng)”、“萬(wàn)方數(shù)據(jù)——數(shù)字化期刊群”和“解放軍醫(yī)學(xué)圖書(shū)館數(shù)據(jù)庫(kù)（CMCC）”等收錄。

《中國(guó)癌癥雜志》為月刊，大16開(kāi)，80頁(yè)銅版紙（隨文彩圖），每月30日出版，單價(jià)8元，全年96元。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)1007-3639，國(guó)內(nèi)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)CN31-1727/R，郵發(fā)代號(hào)4-575。

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主 編：沈鎮(zhèn)宙

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miR-96 expression in osteosarcoma and the role in cell proliferation and apoptosis

WU De-ming, LIU Xiang, JIANG Chuan, DAI Min (Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang Jiangxi 330006, China)

DAI Min E-mail: leizhen6677@163.com

Background and purpose: MicroRNAs are small non-coding endogenous RNA molecules that can inhibit protein translation partly through binding with target mRNAs. MiR-96 is over expressed in many kinds of human tumor cells. The present study aimed to investigate the expression of miR-96 in osteosarcoma tissues and demonstrate its role in osteosarcoma cell lines proliferation, cell cycle and apoptosis. Methods: The expressions of miR-96 in 40 pairs of osteosarcoma and their adjacent nontumorous tissues were detected by TagMan MGB probe method. The antisense technology was used to decrease the expression of miR-96 in osteosarcoma cells (U2-OS, MG-63), MTT assay and flow cytometry were performed to investigate the effect of miR-96 on the cell proliferation, cell cycles and apoptosis. Results: We examined miR-96 expression levels in 40 pairs of human osteosarcoma and their corresponding nontumorous tissues. miR-96 was found to be over-expressed in 62.5% (25/40) of the osteosarcoma cases (P＜0.05). The cell growth ability of U2-OS and MG-63 cells was significantly inhibited following transfection of antisense-microRNA-oligonucleotides-96 (AMO-miR-96). U2-OS and MG-63 cells were mainly detained in G0/ G1, and the percentage of cells at S and G2/M decreased. In addition, knocking down the expression of miR-96 in U2-OS and MG-63 cells resulted in an increase in early apoptosis. Conclusion: miR-96 is over-expressed in human osteosarcoma. Inhibition of miR-96 expression can not only effectively suppress the growth of U2-OS and MG-63 cells, but also induce cell apoptosis. MiR-96 may serve as a new molecular target for the regulation of gene expression in osteosarcoma.

Osteosarcoma; miR-96; Antisense oligonucleotides

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.008

R738.1

：A

：1007-3639(2013)04-0285-07

2010-10-17

2013-03-13）

戴閩 E-mail:leizhen6677@163.com