三種防腐劑對(duì)馬鈴薯薯塊干腐病菌的毒力及抑制作用

李 梅， 田世龍＊， 程建新， 李守強(qiáng)， 葛 霞， 張 欣

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，蘭州 730070；2.甘肅蘭州理工大學(xué)，蘭州 730070）

馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ霓r(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，近幾年隨著糧食安全問(wèn)題備受重視，其栽培面積不斷擴(kuò)大，貯量也隨之增加，但由于部分地區(qū)貯藏條件不夠完善，導(dǎo)致馬鈴薯貯藏期腐爛問(wèn)題日漸突出，貯藏病害對(duì)馬鈴薯的危害也逐年增加［1]。干腐病是目前馬鈴薯貯藏期間發(fā)生較嚴(yán)重的一種真菌性病害，早期估計(jì)其造成的損失每年平均達(dá)6%～10%，有時(shí)甚至高達(dá)60%，給馬鈴薯的鮮食和加工帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響馬鈴薯貯藏保鮮的瓶頸問(wèn)題之一［2]。

馬鈴薯塊莖干腐病可通過(guò)降低采收、貯藏和運(yùn)輸?shù)膿p傷或?qū)⑵滟A藏于有利于傷口愈合的環(huán)境中來(lái)控制病原物的侵染，但主要還是通過(guò)采后使用化學(xué)合成殺菌劑噻菌靈。然而，諸如接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）等病原物對(duì)噻菌靈的抗藥性普遍增加，且農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問(wèn)題受到普遍關(guān)注［2]，因此，必須尋求新的、更適宜的解決途徑和控制措施，以逐步取代和減少此類(lèi)化學(xué)殺菌劑的使用，對(duì)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康及可持續(xù)發(fā)展具有極為重要的意義。本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)二氧化氯、仲丁胺和過(guò)氧乙酸三種熏蒸型防腐劑進(jìn)行室內(nèi)生物測(cè)定和體內(nèi)效果試驗(yàn)，以明確其抑菌效果，為其取代液體類(lèi)且毒性強(qiáng)的防腐劑控制馬鈴薯干腐病的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑

二氧化氯（FEL，含量12%）：天津市張大科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；仲丁胺（FEZ，含量98%）：上海特種精細(xì)化工試劑廠(chǎng)生產(chǎn)；過(guò)氧乙酸（FEG，含量15%）：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 供試菌株

供試馬鈴薯干腐病病原物硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureumSchlechtendahl）由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.3 主要儀器

SW－CJ－2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ－LS－75G全自動(dòng)立式高壓滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PQX型多段可編程人工氣候箱：上海寧波東南儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種準(zhǔn)備

供試馬鈴薯干腐病病原物硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）于試驗(yàn)前7d轉(zhuǎn)接活化，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.2.2 室內(nèi)生物測(cè)定

采用瓊脂孔注入法［3]。將高壓滅菌的瓊脂培養(yǎng)基趁液態(tài)倒入干燥滅菌的直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30mL，待培養(yǎng)基冷凝后，用微量移液器加入孢子濃度為1×107個(gè)／mL的菌懸液100μL后涂布平板，然后用無(wú)菌金屬打孔器（d＝5mm）打成直徑5mm的小孔，用無(wú)菌牙簽除去孔內(nèi)瓊脂后，在孔內(nèi)加1～2滴1%瓊脂液密封孔底面，等瓊脂冷凝后在每個(gè)孔內(nèi)加入不同濃度防腐劑，立即用封口膜封口，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，并用無(wú)菌水作為對(duì)照。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。然后將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，待對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3 馬鈴薯薯塊抑菌試驗(yàn)

參照畢陽(yáng)的方法［4]，選擇貯藏于4℃下的外觀(guān)整齊，無(wú)病蟲(chóng)害的馬鈴薯塊莖，先用清水清洗后，再用1%的漂白粉浸泡5min左右進(jìn)行表面消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，75%乙醇表面消毒，最后用滅菌鐵釘（直徑3.5mm）在塊莖上均勻刺5mm×3mm的傷口3個(gè)，然后立即用微量移液器接種孢子懸浮液20μL，接種2h后的塊莖分別用FEL（150、450、750μg／kg）、FEZ（55、95、135μg／kg）和 FEG（105、140、175μg／kg）各3個(gè)濃度在密閉空間中熏蒸24h，取出后用塑料袋包裝，分別于室溫（25±2）℃和（4±1）℃條件下貯藏，10d后測(cè)定（25±2）℃ 貯藏條件下的發(fā)病率及病斑直徑，30d后測(cè)定（4±1）℃ 貯藏條件下的發(fā)病率及病斑直徑。每處理6個(gè)薯塊，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值，計(jì)算抑菌圈的面積。

相對(duì)抑制率（%）＝處理抑菌圈面積／對(duì)照生長(zhǎng)面積×100；

發(fā)病率（%）＝發(fā)病病斑數(shù)／接種病斑總數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS7.5進(jìn)行直線(xiàn)回歸統(tǒng)計(jì)分析，求出藥劑的毒力方程、EC50和EC90；進(jìn)行Duncan’s多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種防腐劑對(duì)干腐病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

從表1可以看出，F(xiàn)EL、FEZ和FEG 3種防腐劑對(duì)馬鈴薯干腐病均具有顯著的抑制作用，不同濃度防腐劑對(duì)病原菌的抑制存在明顯的差異。在3種防腐劑分別供試的6個(gè)濃度處理中，隨著濃度的增加，病菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制，當(dāng)藥液濃度分別達(dá)0.56、0.42μg／mL和0.69μg／mL時(shí)病菌生長(zhǎng)完全被抑制，相對(duì)抑制率達(dá)100%。

2.2 三種防腐劑對(duì)干腐病病原菌的室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果

由表2室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果可知，馬鈴薯干腐病病原菌對(duì)FEZ、FEL和FEG三種防腐劑均比較敏感，EC50分別為0.202 8、0.349 0μg／mL和0.282 4μg／mL，EC90分別為0.459 3、0.626 1μg／mL和0.708 9μg／mL。

表1 三種防腐劑對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用1）Table 1 Inhibition effect of three kinds of preservatives on mycelial growth of the pathogen of potato dry rot

表2 三種防腐劑對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果Table 2 The indoor toxicity of three kinds of preservatives to the pathogen of the potato dry rot

2.3 三種防腐劑對(duì)干腐病病原菌室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果的差異顯著性分析

由表3致死劑量比率測(cè)定分析可知，F(xiàn)EZ和FEL、FEZ和FEG、FEL和FEG 50%致死劑量（EC50）比率的95%置信區(qū)間中均不包含1，其FEZ和FEL、FEZ和FEG、FEL和FEG藥劑的EC50差異顯著；FEZ和 FEL、FEZ和 FEG、FEL和FEG 90%致死劑量（EC90）比率的95%置信區(qū)間中均包含1，其FEZ和FEL、FEZ和FEG、FEL和FEG藥劑的EC90差異不顯著。

2.4 三種防腐劑對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病發(fā)病的影響

由圖1～3可以看出，3種防腐劑處理對(duì)常溫和低溫條件下貯藏的接種馬鈴薯塊莖的發(fā)病情況具有不同的控制效果。常溫條件下，3種防腐劑處理對(duì)馬鈴薯塊莖的發(fā)病率無(wú)影響，均為100%（圖2），但對(duì)發(fā)病薯塊病斑的擴(kuò)展具有一定的抑制作用；其中FEZ2（95μg／kg）處理可明顯（P＜0.05）抑制薯塊病斑的擴(kuò)展速度，其病斑直徑最小，為7.34mm（圖1）。低溫條件下，3種防腐劑處理均降低了馬鈴薯塊莖的發(fā)病率，其中以FEZ處理效果最佳；貯藏30d，對(duì)照的發(fā)病率已達(dá)100%，而FEZ處理的發(fā)病率為8.33%～25%，其中FEZ2（95μg／kg）處理者的發(fā)病率最低，僅為8.33%（圖4）；同時(shí)對(duì)發(fā)病薯塊病斑的擴(kuò)展速度具有顯著（P＜0.05）抑制作用，其中FEZ2（95μg／kg）處理病斑直徑最小，為4.58mm（圖3）。

表3 三種防腐劑對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果的差異顯著性分析Table 3 Analysis of significant difference on indoor toxicity of three kinds of preservatives to the pathogen of the potato dry rot

圖4 低溫條件下3種防腐劑對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病發(fā)病率的影響Fig.4 Effect of three kinds of preservatives on the incidence of the potato dry rot at low temperature

3 討論

通過(guò)室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)EL、FEZ和FEG 3種揮發(fā)性防腐劑對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌均具有顯著的抑制作用，且馬鈴薯干腐病病原菌對(duì)3種防腐劑均比較敏感；在一定使用濃度范圍內(nèi)，不同濃度防腐劑對(duì)病菌的抑制存在明顯的差異，隨著濃度的增加，病菌生長(zhǎng)明顯受到抑制；結(jié)合體內(nèi)效果試驗(yàn)表明，在低溫條件下，3種防腐劑處理均不同程度地降低了馬鈴薯塊莖的發(fā)病率，其中以FEZ控制效果最佳，95μg／kg濃度處理可明顯降低馬鈴薯薯塊的發(fā)病率和病斑擴(kuò)展速度。

目前，馬鈴薯栽培面積不斷擴(kuò)大，貯量隨之增加，貯藏病害日漸突出，但相應(yīng)的防腐殺菌措施還相差甚遠(yuǎn)，究其原因主要有以下3個(gè)方面：1）貯藏條件（主要指設(shè)施）不夠完善，缺乏防治的基礎(chǔ)；2）生產(chǎn)中使用的防腐殺菌劑多屬化學(xué)農(nóng)藥類(lèi)，出于安全性，使用范圍受到限制；3）所研究開(kāi)發(fā)的防腐劑多屬液體浸泡薯塊類(lèi)，由于條件限制，缺乏可操作性。為此，篩選開(kāi)發(fā)施用簡(jiǎn)便且安全高效的馬鈴薯防腐劑對(duì)馬鈴薯貯藏病害的控制具有一定的生產(chǎn)實(shí)際意義。

仲丁胺（2－aminobutane，簡(jiǎn)稱(chēng)2－AB）是柑橘皮中的一種天然成分［5]，以其特殊的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，對(duì)多種真菌具有抗菌活性，對(duì)蒜薹、柑橘和葡萄的貯藏期病害均具有良好的控制效果，它可造成果蔬污染部位的堿性環(huán)境，影響侵染真菌的生長(zhǎng)［6]。Eckert等用2－AB的磷酸鹽對(duì)31種病原微生物，包括半知菌類(lèi)、子囊菌和藻狀菌綱的真菌以及細(xì)菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2－AB尤對(duì)真菌效果顯著［7]。二氧化氯（ClO2）是世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）向全世界推薦的A級(jí)廣譜、高效、安全的化學(xué)消毒劑，是目前國(guó)際上公認(rèn)的性能優(yōu)良、效果最好的食品保鮮劑，具有很強(qiáng)的氧化作用，利用對(duì)微生物的細(xì)胞壁有較好的吸附和透過(guò)性能，可與蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使氨基酸分解破壞，進(jìn)而控制微生物蛋白質(zhì)的合成，最后導(dǎo)致微生物死亡［8]。Nora利用ClO2保存馬鈴薯，可以有效殺滅鐮刀菌，防止馬鈴薯軟腐病、干腐病和晚期枯萎病，延長(zhǎng)貯藏期［9]；另外，ClO2處理也可顯著減少番茄［10]、芒果［11]和葡萄［12]果實(shí)的采后病原菌。過(guò)氧乙酸（peracetic acid）是目前所有化學(xué)消毒劑中比較突出的一種消毒劑，依靠強(qiáng)大的氧化作用和通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)的pH，使酶失去活性，損傷微生物，造成微生物死亡［13]。Hanks等研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧乙酸處理水仙花可抑制由尖孢鐮刀菌引起的腐爛［14]，也有研究顯示過(guò)氧乙酸對(duì)核果類(lèi)采后褐變及軟腐病具有一定的效果［15]。本試驗(yàn)得出與上述研究相一致的結(jié)論，但其在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，還涉及多方面的影響因素，例如防腐劑作用機(jī)理、施用工藝的進(jìn)一步完善以及防腐劑施用后對(duì)馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)成分的影響程度、是否對(duì)馬鈴薯發(fā)芽也具有一定的影響等等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。

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