丁淑云，康紹叁，景中民，鄭振武，張秀平，高偉興

(1河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院曹妃甸區(qū)醫(yī)院，河北唐山063000;2河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院;3駐馬店市中心人民醫(yī)院)

聯(lián)合多烯紫杉醇治療雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的有效性已得到臨床研究證實，但發(fā)現(xiàn)其延長患者的生存時間極為有限［1，2］。酪氨酸激酶(JAK)抑制劑AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二睛的脂類衍生物，通過阻斷JAK/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號通路，能夠抑制多種腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)其凋亡。2010年12月～2013年1月，我們觀察了多烯紫杉醇聯(lián)合AG490對前列腺癌DU-145細胞增殖凋亡的影響，旨在探討二者聯(lián)合應(yīng)用治療晚期前列腺癌的可行性及機制。

1 材料與方法

1．1 材料 人前列腺癌細胞株DU-145購自中國科學(xué)院上海細胞庫。多烯紫杉醇為Sigma公司產(chǎn)品，AG490為Merck公司產(chǎn)品，胎牛血清、胰蛋白酶及F12培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品，噻唑藍(MTT)購自天津灝洋生物有限公司。Annexin-V凋亡試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品。Bcl-2兔抗人多克隆抗體和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物制品有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 將 DU-145細胞(培養(yǎng)于含有90%F12的培養(yǎng)液中)置于含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液1次。細胞90%匯合時用0．25%胰蛋白酶消化傳代，每周2、3次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1．2．2 細胞干預(yù)及細胞生長抑制率檢測 將DU-145細胞以1×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，150μL/孔，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后分為三組。紫杉醇組分別加入10、100、1 000 nmol/L的多烯紫杉醇;AG490組分別加入 10、20、40、80 μmol/L的AG490;聯(lián)合組分為聯(lián)合1、2、3組，分別加入10、100、1 000 nmol/L的多烯紫杉醇及40μmol/L的AG490，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。對照組不做特殊處理，每天更換F12培養(yǎng)基。終止前4 h每孔加入MTT溶液20μL(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)，終止時吸盡培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 50μL水平搖床上振蕩10 min，于酶標儀上(波長490 nm)測定各孔吸光度值(OD值)。細胞生長抑制率(%)=1-(藥物組平均OD值/對照組OD值)×100%。

1．2．3 細胞干預(yù)及細胞凋亡率檢測 將DU-145細胞懸液(1×106個)接種于6孔培養(yǎng)板中，紫杉醇組加入濃度為100 nmol/L的多烯紫杉醇;AG490組加入濃度為40μmol/L的AG490;聯(lián)合組加入上述兩種藥物(濃度同上)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h;對照組不做特殊處理，每天更換F12培養(yǎng)基。收集貼壁及懸浮細胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液。加入PBS(pH=7．4)2 mL洗滌，1 000 r/min，離心5 min。棄上清液，將細胞重懸于200μL Binding Buffer;加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300μL Binding Buffer，l h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1．2．4 細胞干預(yù)及Bcl-2表達檢測 將DU-145細胞以1×104/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，150μL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，細胞分組及干預(yù)同1．2．3。干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，傾去培養(yǎng)液，每孔PBS洗2次，3 min/次，每孔加4%多聚甲醛2 mL，固定細胞30 min，PBS洗2 min×3次，制成細胞爬片。按照免疫組化染色試劑盒使用說明書進行操作，以PBS替代第一抗體作為陰性對照。結(jié)果判定:Bcl-2陽性染色為細胞質(zhì)棕黃色顆粒。排除爬片邊緣細胞，隨機觀察10個高倍視野，計算高倍視野細胞中Bcl-2蛋白陽性細胞百分數(shù)，取平均值作標記指數(shù)(PI)，PI=(視野中陽性細胞數(shù))/(視野中陽性細胞數(shù)+視野中陰性細胞數(shù))×100%。

1．2．5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗和方差分析。以P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細胞生長抑制率 不同濃度多烯紫杉醇干預(yù)對DU-145細胞生長抑制率的影響見表1，不同濃度AG490干預(yù)對DU-145細胞生長抑制率的影響見表2，多烯紫杉醇及AG490聯(lián)合干預(yù)對DU-145細胞生長抑制率的影響見表3。分析表1～表3結(jié)果，紫杉醇、AG490及二者聯(lián)合應(yīng)用對DU-145細胞增殖均有明顯抑制作用，且呈時間和劑量依賴性。各干預(yù)組細胞生長抑制率與對照組(0 nmol/L)比較，P均＜0．05;聯(lián)合組分別與紫杉醇組及AG490組比較，P均 ＜0．05。

2．2 細胞凋亡率 干預(yù)48 h后對照組、紫杉醇組、AG490組及聯(lián)合組細胞凋亡率分別為(7．25±1．08)%、(27．14 ± 3．27)%、(21．29 ± 3．89)%、(57．45±5．06)%。各實驗組與對照組比較，P均＜0．05，聯(lián)合組分別與紫杉醇組、AG490組比較，P均

表1 不同濃度多烯紫杉醇干預(yù)對DU-145細胞生長抑制率的影響(%，ˉx ± s)

表2 不同濃度AG490對DU-145細胞生長抑制率的影響(%，ˉx ±s)

表3 多烯紫杉醇與AG490聯(lián)合應(yīng)用對DU-145細胞生長抑制率的影響(%，ˉx±s)

2．3 細胞 Bcl-2蛋白表達 對照組、紫杉醇組、AG490組及聯(lián)合組 Bcl-2蛋白陽性表達率分別(70．45 ± 5．24)%、(40．15 ± 7．36)%、(31．78 ±6．79)%、(10．05 ±1．24)%，各干預(yù)組與對照組比較，P均 ＜0．05，其中聯(lián)合組分別與紫杉醇組、AG490組比較，P均 ＜0．05;紫杉醇組與 AG490組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

多烯紫杉醇是一種半合成的紫杉醇類衍生物，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過促進細胞微管聚合，阻止微管正常的生理解聚，將細胞周期阻滯于G2/M期，影響細胞有絲分裂過程，從而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡［3，4］。有報道，多烯紫杉醇聯(lián)合潑尼松可延長AIPC患者生命，降低死亡風(fēng)險，療效及耐受性優(yōu)于多烯紫杉醇與其他藥物聯(lián)合，目前是AIPC患者的一線標準治療方案［1］。但其臨床療效并不盡如人意，患者中位生存時間僅為18．9個月，死亡風(fēng)險僅降低24%。因此，探討晚期前列腺癌發(fā)生激素抵抗的機制和尋找合適的聯(lián)合藥物是目前研究的熱點和難點之一。

JAK/STAT信號通路是與細胞生長、增殖、分化關(guān)系十分密切的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其基本作用模式為:配體與受體結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化;激活JAK;JAK將STAT磷酸化;STAT形成二聚體，暴露出入核信號;STAT進入核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因表達［5］。Lee等［6］研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT通路異常激活與包括前列腺癌在內(nèi)的諸多腫瘤細胞增殖、分化及凋亡密切相關(guān)。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二睛的脂類衍生物，結(jié)構(gòu)類似于酪氨酸，可與受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置，特異性阻滯各種細胞因子引起的JAK2和下游分子STAT3的磷酸化激活，從而阻斷JAK/STAT信號通路。劉青娟等［7］實驗證實，高糖通過激活小鼠足細胞中JAK/STAT信號通路，誘導(dǎo)足細胞轉(zhuǎn)分化，采用AG490進行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，足細胞中 α-SMA蛋白及其 mRNA表達明顯降低。AG490作為抗腫瘤藥物已用于臨床治療白血病，特別是對JAK2異?；罨瘜?dǎo)致的前B急性淋巴細胞白血病具有很好的治療作用，且毒副作用很?。?］，但其應(yīng)用于治療前列腺癌的報道較少。

本研究結(jié)果顯示，多烯紫杉醇和AG490在作用于DU-145細胞24 h和48 h后，隨著各自藥物濃度的增加，細胞增殖受到顯著抑制，且呈時間和劑量依賴性。兩者聯(lián)合作用于DU-145細胞24 h和48 h后，隨著多烯紫杉醇濃度的增加，細胞抑制率增加，也呈時間和劑量依賴性;多烯紫杉醇聯(lián)合AG490在作用于DU-145細胞48 h后，可顯著誘導(dǎo)細胞凋亡，其中聯(lián)合組細胞凋亡率高于紫杉醇組及AG490組。上述結(jié)果說明多烯紫杉醇和AG490均可抑制DU-145細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡;二者聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用。

Bcl-2作為抑制凋亡基因家族中一個重要成員，被稱為細胞死亡調(diào)節(jié)因子，其通過抑制細胞的程序性死亡過程而延長細胞的壽命，使細胞的數(shù)量增多，基因變異的可能性增加，進而有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。Dingemans等［10］的研究顯示，多烯紫杉醇能誘導(dǎo)Bcl-2蛋白的磷酸化，導(dǎo)致Bcl-2/bax異二聚體減少，Bcl-2/bax二聚體增加，最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡。Buettner等［11］研究還發(fā)現(xiàn)，STAT的持續(xù)激活可以調(diào)控Bcl-2基因，導(dǎo)致細胞的異常增殖和惡變，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，阻斷該通路成為腫瘤治療的新靶點。本研究結(jié)果顯示，各干預(yù)組干預(yù)后Bcl-2蛋白陽性表達率顯著降低，其中聯(lián)合組Bcl-2蛋白陽性表達率變化明顯低于紫杉醇組及AG490組，與上述研究結(jié)果一致。說明多烯紫杉醇和AG490誘導(dǎo)DU-145細胞凋亡均可通過Bcl-2介導(dǎo)。

綜上所述，多烯紫杉醇和AG490均可抑制DU-145細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。二者抗癌機制不同，聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，可提高化療療效、降低化療藥物濃度，減輕化療副作用，防止或延緩腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。但對于AG490用于AIPC治療的毒副反應(yīng)，二者最佳濃度搭配及用藥先后順序等問題還有待于進一步研究。

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