施開創(chuàng)，林昌華，張步嫻，官家明，李 軍，鐘 誠＊

（1.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可以引起以母豬繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬呼吸道疾病為特征的豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）。該病于1987年最早在美國發(fā)現(xiàn)[1]，現(xiàn)呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。目前，PRRSV可以分為兩種基因型，即以VR－2332株[2]為代表的美洲型毒株和以LV株[3]為代表的歐洲型毒株，兩者基因組間核苷酸序列的同源性僅為60%左右[4]。1996年我國首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株[5]；2006年分離到以NSP2編碼區(qū)存在第481aa和第533～561aa發(fā)生30個氨基酸的不連續(xù)缺失為標(biāo)志的PRRSV美洲型高致病性變異毒株（HPPRRSV）[6]；2010年報道了 PRRSV 歐洲型毒株的存在和流行[7]。說明目前我國PRRSV流行毒株極為復(fù)雜。近年來，國內(nèi)已有對HP－PRRSV流行毒株基因組進(jìn)行測序與分析的報道，但迄今未見對PRRSV廣西地方分離株基因組分子特征進(jìn)行詳細(xì)分析的報道。本研究對PRRSV廣西分離株GX1003株的基因組序列進(jìn)行測定和分析，為了解HP－PRRSV的遺傳變異情況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 PRRSV廣西分離株GX1003株分離自2010年采集的廣西發(fā)病死亡病豬的脾、肺、淋巴結(jié)等組織，經(jīng)接種Marc－145細(xì)胞產(chǎn)生典型細(xì)胞病變（CPE），用RT－PCR及間接免疫熒光抗體試驗（IFA）鑒定，證實為PRRSV毒株后置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、pMD18－T載體、5′Full RACE Kit及3′Full RACE Kit，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照PRRSV JXA1株基因組序列（GenBank登錄號EF112445），設(shè)計并合成14對擴(kuò)增區(qū)域相互重疊的特異性引物，用于擴(kuò)增GX1003株全基因組片段；基因組的5′端和3′端分別采用5′Full RACE Kit和3′Full RACE Kit進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。

表1 用于擴(kuò)增PRRSV基因組序列的引物Table1 Primers used to amplify PRRSV genome

1.2.2 PRRSV GX1003株基因組的分段擴(kuò)增及測序取GX1003株第3代細(xì)胞毒上清，按照試劑盒說明書提取總RNA，利用RNA PCR Kit反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此為模板，建立50μL PCR反應(yīng)體系：5×PCR buffer（含dNTP Mixture、Mg2＋）10μL，Ex Taq聚合酶（5U／μL）0.25μL，cDNA 5μL，上下游引物（25pmol／μL）各0.5μL，加雙蒸水至50μL。PCR反應(yīng)程序：94℃3min；94℃30s，56℃～59℃30s，72℃120s，35個循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，陽性克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定后，送寶生物工程（大連）有限公司測序。每個擴(kuò)增片段均送3個克隆進(jìn)行重復(fù)測序。

1.2.3 PRRSV GX1003株基因組序列分析 利用Lasergene 7.1對各片段序列進(jìn)行拼接，獲得GX1003株全基因核苷酸序列。應(yīng)用DNA Star軟件包對國內(nèi)外PRRSV美洲型及歐洲型參考毒株基因組進(jìn)行核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的比對分析，并利用MEGA 5.0軟件包的Neighbor－joining方法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV GX1003株基因組的分段擴(kuò)增和測序

利用14對特異性引物、5′Full RACE Kit及3′Full RACE Kit，對GX1003株基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，得到16個與預(yù)期目的片段大小一致的擴(kuò)增片段。經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測序、拼接后，獲得GX1003株全基因序列長度為15320nt[不包括Poly（A）]?；蚪M首先是5′UTR；其后為9個開放閱讀框（ORF）ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7，其中ORF1a編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2～8，ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSP9～12，ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b（E）、GP3、GP4、GP5、M 和N；最后是3′UTR和Poly（A）尾。GX1003株基因組的組成見表2。已將GX1003株全基因序列發(fā)表在GenBank上，登錄號為JX912249。

表2 GX1003株基因組組成及編碼蛋白Table2 The composition of genome and the encoded proteins of GX1003strain

2.2 PRRSV毒株間基因組序列同源性分析

GX1003株與國內(nèi)外PRRSV美洲型和歐洲型代表毒株的同源性見表3。GX1003株與比較的美洲型毒株基因組核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為85.0%～99.4%及82.1%～99.1%，與歐洲型代表株LV株的同源性分別為60.6%及51.3%。

GX1003株與比較的美洲型毒株5′UTR核苷酸序列的同源性為92.1%～100.0%，與LV株的同源性為62.8%；與比較的美洲型毒株3′UTR核苷酸序列的同源性為88.0%～98.7%，與LV株的同源性為70.8%。與比較的美洲型毒株ORF1a～ORF1b核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為82.0%～99.6%和80.3%～99.7%，與LV株的同源性分別為56.6%～63.3%及48.4%～68.9%；與比較的美洲型毒株NSP1～NSP12核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為75.5%～100.0%和70.7%～100.0%，與LV株的同源性分別為50.5%～68.8%及49.5%～75.0%；與比較的美洲型毒株ORF2～ORF7核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為85.8%～100.0%和86.1%～100.0%，與LV株的同源性分別為64.1%～69.7%和56.7%～80.5%。對各區(qū)域的核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，ORF1a同源性最低，ORF6／M同源性最高（表3）。

2.3 PRRSV GX1003株與JXA1株、VR－2332株和RespPRRS MLV株的比對分析

將GX1003株基因組核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列與HP－PRRSV代表株JXA1株進(jìn)行比對分析，其主要變異結(jié)果見表4。與JXA1株相比，GX1003株在非編碼區(qū)5′UTR沒有發(fā)生變異，只在3′UTR發(fā)生2個nt的突變；在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF1a、ORF1b中，GX1003株發(fā)生了74個nt、24個aa的突變，其中ORF1a有55個nt、19個aa發(fā)生突變，僅NSP2編碼區(qū)就有21個nt、11個aa發(fā)生了突變；ORF1b有19個nt、5個aa發(fā)生突變，僅NSP9編碼區(qū)就有11個nt、3個aa發(fā)生了突變；而與VR－2332株相比，GX1003株在NSP2蛋白第481位aa和第533～561位aa出現(xiàn)30個aa的不連續(xù)缺失，具有HP－PRRSV的遺傳特征。與JXA1株相比，GX1003株在結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF2～ORF7中，有27個nt、18個aa發(fā)生了突變，僅ORF4編碼區(qū)就有10個nt、6個aa發(fā)生了突變。整個基因組沒有核苷酸缺失和插入的現(xiàn)象?？梢?，NSP2、NSP9及ORF4為GX1003株基因組突變的高發(fā)區(qū)。

表3 GX1003株核苷酸及氨基酸序列與代表株的同源性分析Table3 The nucleotide and amino acid identity of GX1003compared with those of other PRRSV isolates

表4 GX1003株與JXA1株各基因編碼區(qū)比對分析Table4 Genomic region comparison of GX1003 strain with JXA1strain

將GX1003株與美洲型疫苗株RespPRRS MLV（GenBank登錄號 AF159149）、美洲型經(jīng)典株 VR－2332株以及變異株JXA1株氨基酸序列進(jìn)行比較，重要氨基酸位點的變異情況見表5。Allende R等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV全基因序列中，有9個氨基酸的變異與PRRSV的毒力相關(guān)，其中4個位于非結(jié)構(gòu)蛋白、5個位于結(jié)構(gòu)蛋白。4個位于非結(jié)構(gòu)蛋白的毒力相關(guān)位點中，它們在VR－2332株的位置分別為S331（NSP1β）、S668（NSP2）、E952（NSP2）（JXA1株相應(yīng)位點為 E922）、Y952（NSP10），而疫苗株 RespPRRS MLV在這4個位點上發(fā)生突變，分別為S331→F331、S668→F668、E952→K952和Y952→H952（表5）。本研究的GX1003株非結(jié)構(gòu)蛋白在這4個位點都沒有發(fā)生變異。5個位于結(jié)構(gòu)蛋白的毒力相關(guān)位點中，它們在VR－2332株的位置分別為L10（GP2）、G83（GP3）、R13（GP5）、R151（GP5）、Q16（M），而疫苗株RespPRRS MLV在這5個位點均發(fā)生了變異，分別由L10→F10、G83→E83、R13→Q13、R151→G151、Q16→E16。本研究的GX1003株結(jié)構(gòu)蛋白在L10、R13、R151、Q16位點均未發(fā)生變異，而G83→S83（與JXA1株一致）（見表5）。以上結(jié)果表明，GX1003株具有強毒株的序列特征。

2.4 PRRSV不同毒株遺傳進(jìn)化分析

基于病毒全基因組核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹（圖1），可以將GX1003株及對比的國內(nèi)外美洲型PRRSV參考毒株分為4個亞群，即以VR－2332株為代表的亞群1、以CH－1a株為代表的亞群2、以HB－1株為代表的亞群3、以JXA1株為代表的亞群4。GX1003株屬于以JXA1株為代表的亞群4。

表5 GX1003株與RespPRRS MLV株、VR－2332株和JXA1株的氨基酸位點變異分析Table5 Amino acid changes among GX1003，RespPRRS MLV，VR－2332and JXA1strain

圖1 基于病毒全基因組核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of complete genome of viruses

3 討論

全基因序列分析發(fā)現(xiàn)，GX1003株與PRRSV美洲型代表毒株全基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為85.0%～99.4%和82.1%～99.1%，與歐洲型代表毒株LV株的同源性分別為60.6%和51.3%，同時GX1003株在NSP2編碼區(qū)存在第481位aa和第533～561位aa 30個氨基酸的不連續(xù)缺失，表明GX1003株屬于 HP－PRRSV。并且，GX1003株在9個潛在的毒力相關(guān)氨基酸位點中保持S331（NSP1β）、S668（NSP2）、E922（NSP2）、Y952（NSP10）、L10（GP2）、R13（GP5）、R151（GP5）、Q16（M）不變（除GP3的G83發(fā)生與JXA1株一致的G83→S83），具有致病性毒株的序列特征。因此可以推測，GX1003株屬于美洲型 HP－PRRSV，具有高致病性。但也有學(xué)者認(rèn)為，PRRSV分離株NSP2出現(xiàn)30個aa的不連續(xù)缺失與分離株的致病性無關(guān)，只能作為 HP－PRRSV的遺傳標(biāo)志[9]，分離株的實際致病性如何有賴于動物回歸試驗。GX1003株對仔豬的致病性試驗正在進(jìn)行之中。

美洲型毒株與歐洲型毒株之間基因組差異很大，其核苷酸序列的同源性僅為60%左右[4]，并且美洲型毒株之間、歐洲型毒株之間基因組亦存在較大的遺傳變異[10－11]，這種變異還在持續(xù)加大之中[12]。就國內(nèi)而言，不論是美洲型傳統(tǒng)毒株、高致病性變異毒株，還是歐洲型毒株均有爆發(fā)和流行的報道[5－7]，臨床上流行毒株日益復(fù)雜，但當(dāng)前國內(nèi)仍以NSP2蛋白發(fā)生第481aa和第533～561aa 30個aa不連續(xù)缺失為遺傳標(biāo)志的美洲型HP－PRRSV為優(yōu)勢流行毒株[13]。值得注意的是，與 HP－PRRSV代表株JXA1株相比，近年來各地分離到的 HPPRRSV毒株還在不斷發(fā)生新的變異，出現(xiàn)大量具有不同變異特點的流行毒株[14－16]。本研究中，與JXA1株相比，GX1003株全基因共發(fā)生103個nt、42個aa的突變，分布在不同的編碼區(qū)，以NSP2、NSP9及ORF4為基因組突變的高發(fā)區(qū)，其中NSP2編碼區(qū)發(fā)生21個nt、11個aa的突變，NSP9編碼區(qū)發(fā)生11個nt、3個aa的突變，ORF4編碼區(qū)發(fā)生10個nt、6個aa的突變；整個基因組沒有發(fā)生核苷酸缺失和插入的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，GX1003株雖然屬于HP－PRRSV，但基因組發(fā)生了新的遺傳變異，有其自身特點。

基于PRRSV全基因序列的遺傳進(jìn)化樹，可以將所有美洲型參考毒株分為4個亞群，GX1003株在遺傳進(jìn)化樹上屬于亞群4。近年來，以高致病性變異毒株JXA1株為代表的亞群4已成為我國的流行優(yōu)勢毒株[13]，是當(dāng)前國內(nèi)防控的重點對象。但各地的流行病學(xué)調(diào)查表明，由傳統(tǒng)毒株導(dǎo)致的PRRS疫情還占有一定的比例[17－18]，在防控實踐中不容忽視。因此，加強臨床監(jiān)測及分子流行病學(xué)研究，及時掌握日益復(fù)雜的流行毒株及其遺傳變異特點，對選擇有效的疫苗以及采取其他有針對性的防控措施具有重要意義。本研究對PRRSV GX1003株全基因組進(jìn)行測序和分析，豐富了國內(nèi)PRRSV分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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