艾 國，肖 芳，范翔雪，張元亞，焦云桃，黃加權(quán)，嚴偉明，寧 琴

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染科，湖北 武漢 430030

Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)被內(nèi)、外源性配體不恰當?shù)募せ睿肿幽M和抗原提呈細胞活化導致的自身抗原提呈的增強以及TLR 介導的調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)數(shù)量及功能的缺失會導致自身免疫現(xiàn)象。作為脂多糖(LPS)作用的優(yōu)先受體，TLR4 參與LPS介導的細胞激活及損傷。TLR4及其信號轉(zhuǎn)導在HBV感染、酒精性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝臟纖維形成、肝臟缺血再灌注等肝臟的各種損傷中發(fā)揮不同的重要作用。然而其在自身免疫性肝炎中的表達和作用目前鮮有報道，本實驗擬通過對實驗性自身免疫性肝炎(EAH)小鼠模型的研究，探討TLR4 在自身免疫性肝炎中的表達和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級C57BL/6 小鼠32只，雌性，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染免疫室動物房IVC(智能型獨立送回風凈化籠具)，常規(guī)供給清潔飼料及飲水。

1.2 試劑 兔抗TLR4 多克隆抗體及無關(guān)抗體兔IgG(購于武漢博士德生物有限公司)、免疫組化SP 兔二步法試劑盒及DAB 試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司);TRIzol 試劑(美國Invitrogen 公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA 聚合酶、SYBR GreenⅠ熒光染料(日本東洋紡Toyobo 公司);PCR 擴增引物(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司);弗氏完全佐劑(美國Sigma 公司)。

1.3 EAH 模型的建立及分組 將4只4周齡雌性C57BL/6 小鼠的肝臟用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)行門靜脈灌注;取出肝臟置于冰上剪碎，勻漿后以150×g 離心10 min 以去除細胞核部分，使肝細胞內(nèi)蛋白質(zhì)充分釋出;以100 000×g的速度超速離心1 h，該上清液即含肝抗原(S-100 抗原);采用90 cm 瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B 柱(Pharmacia 公司)分離S-100，收集10 mg/L的第1 峰(S-100/1)作為刺激T 細胞的抗原即LSP(liver-specific lipoprotein)。將小鼠按照數(shù)字分組方法隨機分為2組，每組各12只;正常組不給予任何處理，模型組第1 天和第7 天以新鮮制備的0.5～2 g/L的LSP 0.5 ml 與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)充分乳化后予以小鼠腹腔注射。兩組小鼠于第28 天各處死6只:乙醚麻醉后摘取眼球采集外周血，離心后收集血清送本院檢驗科檢測生化指標，并于采血后脫頸處死小鼠，取出肝脾組織，部分以4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，部分用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝組織病理學觀察 肝臟用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋、切片，然后行HE 染色，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.5 血清中自身抗體免疫熒光檢查 取新鮮正常大鼠的胃平滑肌進行冰凍切片，分別滴加對照組和模型組的血清(均按1∶5 稀釋)，37℃濕盒孵育60 min;PBS清洗;滴加FITC 羊抗小鼠IgG(1∶50)，37℃濕盒孵育30 min;PBS 清洗;防熒光淬滅劑封片;熒光顯微鏡下觀察，拍照。熒光顯微鏡下可見到較為明顯的線性熒光，證明血清中存在抗平滑肌抗體即呈陽性。

1.6 Masson 膠原纖維染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染液5～10 min，流水稍洗，1%鹽酸分化。流水沖洗數(shù)分鐘。Masson 復合染色液5～10 min，蒸餾水稍沖洗。1%磷鎢酸液處理約5 min，直接用苯胺藍液復染5 min，然后1%冰醋酸水處理1 min。無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果判定:膠原纖維呈灰藍色(用苯胺藍液復染)，胞質(zhì)、肌纖維和紅細胞呈紅色，胞核呈藍色。

1.7 Realtime-PCR 檢測肝脾組織TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達 將100 mg 肝組織或脾臟組織加入1 ml TRIzol 置勻漿器中，氯仿－異丙醇法提取總RNA。經(jīng)紫外分光光度計定量后，取1μg RNA，20μl逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，然后用SYBR GreenⅠ熒光染料技術(shù)行實時定量PCR 反應(yīng):即在20μl PCR 反應(yīng)體系進行PCR 擴增。引物設(shè)計:①內(nèi)參GADPH:5'-CAGTGCCAGCCTCTGCTCAT-3' (上 游)，5'-ATACTCAGCACCAGCACAT-3' (下游);②TLR4:5'-GCAAAG TCCCTGATGACATTCC-3' (上 游)，5'-AAGCCATGCCATGCCTTGTC-3' (下游);③MyD88:5'-GCATGGTGGTGGTTGTTTCTG-3' (上 游)，5'-GAATCAGTCGCTTCTGTTGG-3' (下游)。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，主循環(huán)40個，72℃終延伸10 min。實時熒光定量PCR結(jié)果分析采用2-△△CT法，通過Ct 值計算獲得最終結(jié)果。

1.8 肝組織TLR4 免疫組化檢測 肝組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水后，每張玻片加1 滴過氧化酶阻斷液室溫孵育10 min，PBS 沖洗3次，每次5 min。用枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(高火5 min，然后低火15 min)，自然冷卻，加1 滴非免疫性動物血清，室溫孵育15 min，傾去不洗，加50 ul 一抗(兔抗TLR4 多克隆抗體，稀釋比例為1:100)，4℃孵育過夜，PBS 沖洗，加1 滴羊抗兔二抗溶液，室溫孵育30 min，PBS 沖洗3次，滴加新鮮配制的DAB 溶液約10 s染色，PBS 沖洗10 min，蘇木素復染約8 s，注意顯微鏡下觀察控制染色時間。梯度酒精脫水后中性樹膠封片。細胞胞質(zhì)、胞核或胞膜呈棕黃色且背景清晰者為陽性。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0 進行統(tǒng)計學分析，GraphPad prism 5.0 作統(tǒng)計繪圖，實驗數(shù)據(jù)用表示，兩組計量資料數(shù)比較用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EAH 小鼠肝臟病理學改變及Masson 膠原染色模型組小鼠在匯管區(qū)和小葉中央觀察到不同程度的炎癥反應(yīng)。淋巴細胞彌漫性分布于中央靜脈周圍的肝血竇內(nèi)，部分肝細胞出現(xiàn)氣球樣變和嗜酸性壞死，部分肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，呈點灶狀壞死(見圖1)。正常組Masson 染色只在血管壁彈力纖維顯色，胞質(zhì)、肌纖維和紅細胞呈紅色，而模型組除此之外，在淋巴細胞浸潤的地方及竇周間隙也有膠原纖維沉積呈現(xiàn)灰藍色，說明肝臟有肝纖維化的表現(xiàn)(見圖2)。將血清滴加在大鼠胃腸平滑肌冰凍切片上行血清中自身抗體免疫熒光檢查，于熒光顯微鏡下可見到較為明顯的線性熒光，證明血清中存在抗平滑肌抗體呈陽性(見圖3)。

2.2 EAH 小鼠肝、脾組織TLR4的mRNA 水平表達Realtime-PCR 檢測肝臟及脾臟組織內(nèi)TLR4 mRNA的表達水平，模型組小鼠肝組織內(nèi)TLR4 mRNA 表達水平較正常組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0357);而脾臟TLR4 mRNA 表達水平較正常組降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.1429，見圖4)。

圖1 小鼠肝臟HE 染色(200×);圖2 小鼠肝臟Masson 膠原染色(200×);圖3 小鼠的血清中抗平滑肌抗體的表達(免疫熒光400×) A:正常組;B:模型組Fig 1 Liver HE staining of C57BL/6(200×);Fig 2 Liver Masson staining of C57BL/6(200×);Fig 3 Expression of serum anti-smooth muscle antibody of C57BL/6(Immuno fluorescence 400×) A:normal group;B:EAH group

圖4 TLR4 mRNA 在EAH 肝脾中的表達(兩組比較，* P＜0.05)Fig 4 Expression of TLR4 mRNA in liver and spleen of C57BL/6

2.3 EAH 小鼠肝、脾組織MyD88的mRNA 水平表達 Realtime-PCR 檢測肝臟及脾臟組織內(nèi)MyD88 mRNA的表達水平，模型組小鼠肝組織內(nèi)MyD88 mRNA表達水平較正常組明顯增高(P=0.0384)，而脾臟MyD88 mRNA 表達水平較正常對照組略低，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.0，見圖5)。

圖5 MyD88 mRNA 在EAH 肝脾中的表達(兩組比較，* P＜0.05)Fig 5 Expression of MyD88 mRNA in liver and spleen of C57BL/6

2.4 TLR4 蛋白在EAH 小鼠模型肝臟組織中的表達免疫組化檢測TLR4的表達，陽性結(jié)果為細胞漿/細胞膜著棕黃色，胞核呈淡藍色。高倍鏡下觀察正常組小鼠肝組織中未見明顯TLR4 表達，而模型組小鼠肝組織可見到中央靜脈周圍，肝細胞壞死區(qū)和淋巴細胞浸潤區(qū)域有陽性細胞染色(見圖6)。

3 討論

TLR 是近年發(fā)現(xiàn)的一類主要表達于天然免疫細胞表面的模式識別受體，能選擇性識別大量的病原相關(guān)分子模式，快速啟動天然免疫應(yīng)答;TLR對獲得性免疫的調(diào)節(jié)主要是通過誘導抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)的成熟，上調(diào)共刺激分子的表達并促進其分泌細胞因子實現(xiàn)的。此外，TLR 也可以直接調(diào)節(jié)T 細胞應(yīng)答［1］。近來研究發(fā)現(xiàn)，TLR 表達于各種肝臟細胞中，可以調(diào)節(jié)肝臟細胞的天然免疫反應(yīng)，參與肝臟病理生理過程［2］。TLR 能夠識別損傷與感染信號，是連接組織損傷、感染和炎癥的橋梁［3］，但過度的TLR 信號也與自身免疫疾病的發(fā)生有關(guān)［4］。自身免疫性肝炎是自身免疫系統(tǒng)攻擊肝臟引起的慢性炎癥和肝細胞壞死，其病理發(fā)病機制目前尚未完全闡明，在PBC中已有相關(guān)研究證明TLR4 在患者進展期門靜脈周圍肝細胞及小葉間肝細胞上表達，參與了其炎癥過程［5］，推測在自身免疫性肝炎中TLR4及其信號轉(zhuǎn)導可能亦涉及。

圖6 免疫組化染色檢測TLR4 蛋白在肝臟組織中的表達(400×) A:正常組;B:模型組Fig 6 Expression of TLR4 protein in liver of C57BL/6 by immunohistochemistry (400×) A:normal group;B:EAH group

TLR4 是TLRs 家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，其主要作用是識別G-細菌細胞壁脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，啟動機體的固有免疫系統(tǒng)?；罨疶LR4可以啟動不同的信號通路，誘導產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)包括細胞因子、趨化因子等從而產(chǎn)生強有力的炎癥反應(yīng)。TLR4 信號通路包括MyD88 依賴性和MyD88 非依賴性兩個途徑。MyD88 依賴性途徑主要通過TIK (Toll/IL-1 receptor)向胞內(nèi)傳遞信號，激活c-Jun 氨基端蛋白激酶(INK)和核因子-KB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，引起多種炎性細胞因子和化學因子的釋放，如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-a(tumour necrosis factor-alpha，TNF-a)［6］。

目前已獲國內(nèi)外廣泛認可及使用的自身免疫性肝炎動物模型為采用易感動物C57BL/6 小鼠，以同種系肝抗原與完全弗氏佐劑充分乳化后經(jīng)腹腔注射誘導出EAH。該模型肝臟組織學病理改變與人自身免疫性肝炎的組織學特征相似，都有大量炎癥細胞特別是淋巴細胞的浸潤，伴有不同程度肝細胞壞死和血清轉(zhuǎn)氨酶升高，并且可通過免疫熒光檢測出自身抗體。

本研究成功建立EAH 小鼠模型，肝組織病理學顯示肝臟匯管區(qū)和小葉中央觀察到不同程度的炎癥反應(yīng)，免疫熒光檢查證明血清中存在抗平滑肌抗體陽性。進一步發(fā)現(xiàn)肝臟中的TLR4 mRNA及MyD88 mRNA 表達水平均較正常組明顯增加，脾臟無統(tǒng)計學意義改變，表明肝臟中TLR4/MyD88 信號轉(zhuǎn)導途徑在自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

自身免疫性肝炎由于慢性肝損傷往往伴有不同程度的肝纖維化。Masson 膠原染色可以觀察到自身免疫性肝炎小鼠肝臟淋巴細胞浸潤的地方及竇周間隙有膠原纖維沉積呈現(xiàn)灰藍色，有肝纖維化形成。研究表明，LPS/TLR4 途徑在肝纖維化形成中具有重要作用，盡管在肝臟中枯否細胞表達高水平的TLR4 且被認為是LPS的主要靶點，但表達于肝星狀細胞上的TLR4 則主要促進肝纖維化［7］。因此，肝臟中的TLR4 表達水平增高可能促進肝纖維化，從而參與了自身免疫性肝炎的疾病進程。

TLR4 信號轉(zhuǎn)導通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一，與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展過程相關(guān)，TLR4/MyD88 途徑在自身免疫性疾病中的作用研究仍在進行中，臨床上針對各種阻斷或抑制TLR4 信號通路上各個節(jié)點藥物的研制也是目前醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點，對TLR和MyD88 以及IL-1R 家族的信號轉(zhuǎn)導深入探索有助于理解天然免疫、適應(yīng)性免疫與自身免疫之間的關(guān)系，闡明這些機制將有助于在細胞生物化學水平上更進一步了解自身免疫性疾病的發(fā)病機制，為自身免疫性肝炎等器官特異性自身免疫疾病的基礎(chǔ)和臨床研究提供重要依據(jù)。

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