聯(lián)合抑制Notch和PI3K/Akt 通路對胃癌細胞增殖的影響

李金鵬，于紅剛

武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060

Notch 是一條在進化過程中高度保守的信號通路，參與多種細胞內(nèi)分子生物學過程，如細胞周期轉(zhuǎn)變、分化、增殖、血管生成和上皮細胞間葉樣轉(zhuǎn)變等［1］。磷酸肌醇3/激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路在多種癌細胞中呈現(xiàn)高表達，蛋白激酶B (Akt)的活化位于PI3K 超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的下游，主要負責由PI3K 始動的生物信息的傳導(dǎo)，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)［2］。研究發(fā)現(xiàn)Notch 通路和PI3K/Akt 通路存在著相互作用，共同參與細胞的分子生物學行為［3-5］。本實驗通過應(yīng)用上述兩個信號通路的特異性抑制劑GSI和LY294002 來探討其在胃癌細胞系SGC-7901中的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:胃癌SGC-7901 細胞系由消化疾病湖北省重點實驗室傳代保存。

1.1.2 試劑:RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國GIBCO 生物技術(shù)公司;磷酸化Akt 抗體、Notch-1 抗體以及相關(guān)二抗試劑盒均為CST 公司進口原裝產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和抑制劑GSI 均購自美國的Sigma 公司;LY294002 來源于美國的Alex 公司;提取總蛋白試劑盒及Western blotting 所需的其他試劑來源于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):傳代培養(yǎng)胃癌SGC-7901 細胞于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中。6%CO2濃度、37℃培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 檢測細胞增殖:用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液將貼壁細胞配成單個細胞懸液，濃度為10 000～20 000/ml，每孔體積200μl 細胞接種到96 孔板，細胞貼壁后即加藥。每種處理設(shè)5個復(fù)孔，對照組(不加藥物處理)、LY294002組、GSI組、聯(lián)合處理組共20個實驗孔。LY294002 2 mg/ml(該濃度參考相關(guān)文獻［2］)，每5個孔加10μl，GSI 20 mg/ml(該濃度參考相關(guān)文獻［6］)，每5個孔加1μl。聯(lián)合組藥物用量同單用組。藥物均混勻于無血清培養(yǎng)基后再加入到相應(yīng)孔中。作用24 h 后，每孔加MTT［3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］溶液(5 mg/ml 用PBS 配制，pH=7.4)10μl 繼續(xù)孵育4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加100μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇OD490 nm波長在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果并計算細胞抑制率=(空白組吸光度值均值－各濃度組吸光度值均值/空白組吸光度值均值)×100%，并繪制直方圖。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 六孔板加藥處理:對照組設(shè)1個孔，實驗組LY294002(2 mg/ml)10μl 處理2個孔，GSI(20 mg/ml)1μl 處理1個孔和兩者聯(lián)合(同上濃度同體積)處理2個孔。以細胞長至80%～90%孔域并處于對數(shù)生長期開始加藥，作用24 h 后提取各組總蛋白，行Western blotting 檢測各組磷酸化的Akt和Notch-1 水平(以β-Actin 蛋白為內(nèi)參對照)。步驟包括提取并測定總蛋白濃度、計算20μg 體積下的上樣量、蛋白電泳、纖維膜電轉(zhuǎn)和X 光膠片顯影等。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料兩組間比較采用配對t 檢驗，多組間比較用方差分析，計數(shù)資料采用等級相關(guān)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制劑作用后可抑制癌細胞的增殖 Notch和PI3K/Akt 兩條信號通路的抑制劑GSI和LY294002 均能抑制胃癌SGC-7901 細胞的增殖，抑制增殖率分別為(53.56±2.04)%和(42.93±1.64)%，且二者聯(lián)合應(yīng)用癌細胞的增殖率降低更明顯，為(86.01±2.02)%(見圖1)。GSI和LY294002 單獨處理組分別與抑制劑聯(lián)合處理組抑制率的兩兩配對t 檢驗，得出tGSI=－41.12 (P=0.00)、tLY294002=－89.72 (P=0.00)。

圖1 各處理組胃癌細胞增殖抑制率Fig 1 Cells proliferation inhibition rate of each treated group

2.2 抑制劑作用后可降低Notch-1和p-Akt的表達水平 Notch 信號通路的抑制劑GSI 能降低蛋白Notch-1的表達水平，而p-Akt的表達水平則較對照組增加;PI3K/Akt 通路的抑制劑LY294002 能降低p-Akt的表達水平，Notch-1 水平則無明顯變化;兩種信號通路的抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，p-Akt和Notch-1 蛋白的表達水平均降低(見圖2)。

圖2 抑制劑作用后Notch-1和p-Akt的表達水平 A:GSI可降低Notch-1的表達水平;B:LY294002可降低p-Akt的表達水平;C:抑制劑聯(lián)合處理后可同時降低Notch-1和p-Akt的表達Fig 2 Expression level of Notch-1 and p-Akt after treated by inhibitors A:GSI could reduce the expression of Notch-1;B:LY294002 could reduce the expression level of p-Akt;C:Combination of inhibitors could reduce both expression of Notch-1 and p-Akt simultaneously

3 討論

Notch 基因通過編碼跨膜受體而誘發(fā)多級生物級聯(lián)反應(yīng)從而參與諸如細胞周期轉(zhuǎn)變、分化、增殖、血管生成、細胞遷移和上皮細胞間葉樣變等細胞生物學過程［1，3］。它包括四個受體(Notch-1，2，3，4)和五種配體(jagged-1，jagged-2，Delta 樣受體1、3、4)。當細胞上的Notch 受體與鄰近細胞上的Notch 配體結(jié)合后，Notch通路即被激活［6］。激活的Notch 蛋白在金屬蛋白酶腫瘤壞死因子-α 轉(zhuǎn)化酶(TACE)和γ-分泌酶復(fù)合物(γsecretase complex)的蛋白水解下，釋放其細胞內(nèi)部分ICN，當ICN 進入細胞核后活化Notch-CSL 復(fù)合物，則進一步調(diào)控多個下游靶基因的表達。如果采用γ-分泌酶復(fù)合物的抑制劑GSI 則能阻斷上述過程［7］。

PI3K/Akt 通路在多種癌細胞中呈現(xiàn)高表達，Akt的活化位于PI3K 超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的下游，主要負責由PI3K 始動的生物信息的傳導(dǎo)，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)。采用特異性抑制劑降低其下游磷酸化Akt的水平，從而阻斷Akt的磷酸化活化及其下游信號級聯(lián)反應(yīng)進而阻斷PI3K 通路的生物學效應(yīng)［2］。

本實驗應(yīng)用Notch 信號通路的抑制劑GSI和PI3K/Akt 信號通路的抑制劑LY294002 分別單獨和聯(lián)合處理胃癌SGC-7901 細胞。MTT和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路的抑制劑GSI 能抑制癌細胞的增殖，降低蛋白Notch-1的表達水平，而p-Akt的表達水平則較對照組增加。LY294002 能抑制癌細胞的增殖，并降低p-Akt的表達水平，Notch-1 水平則無明顯變化，兩種信號通路的抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后能明顯降低癌細胞的增殖率，p-Akt和Notch-1 蛋白的表達水平均降低。這就提示Notch 信號通路被抑制后PI3K/Akt信號通路被某種程度的上調(diào)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用PI3K/Akt 通路抑制劑抑制該通路，兩條通路均被抑制，癌細胞的增殖抑制率則更明顯，提示中間存在某個共同的環(huán)節(jié)聯(lián)系這兩條通路。國外學者［3-5］在急性淋巴細胞白血病T 細胞中發(fā)現(xiàn)，Notch 信號途徑能夠激活Pten基因，而該基因的激活能下調(diào)PI3K/Akt 通路的活性。如果Notch 被其抑制劑GSI 抑制，則Pten 基因也被相應(yīng)地抑制，解除了對PI3K/Akt的下調(diào)，表現(xiàn)為Akt 磷酸化活性的增高。如果抑制Notch的同時抑制PI3K/Akt，則癌細胞的抑制率明顯增加，這與本實驗的結(jié)果相符。

國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)胃癌SGC-7901 細胞呈中度表達Pten 基因［8-9］。根據(jù)本次實驗結(jié)果我們推測，Notch 信號通路在胃癌SGC-7901 細胞系中可能通過Pten 基因與PI3K/Akt 通路相聯(lián)系，Notch 調(diào)控Pten，而Pten 調(diào)控PI3K/Akt，共同參與胃癌SGC-7901 細胞系的分子生物學過程。兩信號通路間可能還有其他的分子間作用聯(lián)系，有待進一步發(fā)現(xiàn)和研究。

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