陸少林，張海健，顧 星，時(shí) 運(yùn)，錢(qián) 琦，張 潔，王司曄，姚登福

南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南通 226001

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)為我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，早診和早治是提高生存率的有效措施［1］。膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一，為鈣離子依賴(lài)的磷脂酰結(jié)合蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、惡性轉(zhuǎn)變和PHC 發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［2］。PHC中ANXA2 表達(dá)和Tyr23 殘基磷酸化上調(diào)［3］，可能是PHC 早期診斷和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移血清標(biāo)志物。然而，ANXA2 在HBV 相關(guān)的PHC中的表達(dá)特征和診斷價(jià)值評(píng)估尚未見(jiàn)報(bào)道［4］。本文比較了PHC和良性肝病患者的肝組織和血ANXA2 表達(dá)水平，探討了ANXA2 表達(dá)對(duì)PHC的診斷與鑒別價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 肝組織的收集 經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意，以自身配對(duì)法收集PHC 手術(shù)切除后癌、距癌灶＞3 cm 癌旁和癌灶＞5 cm 遠(yuǎn)癌組織各30 份，于液氮中保存;用于制備肝總RNA，分析ANXA2 mRNA 表達(dá);制備蛋白分析肝組織ANXA2 比濃度;用于免疫組織化學(xué)染色分析肝組織中ANXA2的表達(dá)分布與細(xì)胞定位。PHC 診斷依據(jù)全國(guó)肝癌研究協(xié)作組制定的標(biāo)準(zhǔn)核實(shí)［5］。

1.2 血清樣本 收集115例住院PHC患者血清，男88例，女27例，年齡25～81歲，平均年齡(48.3±11.4)歲;另采集良性肝病患者血清包括慢性肝炎35例、急性肝炎28例、肝硬化38例;所有病例經(jīng)生化檢測(cè)、病毒性標(biāo)志物和超聲檢查確診，于清晨采集血液5 ml，分離血清備用;以放射免疫法檢測(cè)AFP 水平;并以肝炎病毒標(biāo)志物陰性且ALT 正常的30 份健康獻(xiàn)血員血清作對(duì)照。

1.3 總RNA 制備及cDNA 合成 用Trizol 試劑(Invitrogen)分離50 mg 肝組織總RNA，瓊脂糖電泳分析總RNA 完整性，以Bio-RAD smartspecTMplus 核酸儀檢測(cè)RNA 濃度和純度。用cDNA 合成試劑盒(Fermentas)，以1μg 總RNA為模板合成cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 在實(shí)時(shí)定量PCR 儀(Applied Biosystems)上，反應(yīng)體系:含25μl 2× SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，Japan)，2μl 引物混合液(ANXA2 上游，5'-TGAGCGGGATGCTTTGAAC-3'，下 游5'-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-3';β-actin 上游5'-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3'，下游5'-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3');1μl 50×ROX Reference Dye I，4μl cDNA和18μl 雙蒸水，于95℃，2 min;95℃，10 s;62℃，1 min;擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，根據(jù)同時(shí)擴(kuò)增的ANXA2 mRNA和β-actin mRNA的2－△△Ct值變化進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5 Western blotting 預(yù)冷肝組織于4℃勻漿，800×g 離心10 min，上清液以BCA 法(碧云天生物技術(shù)有限公司)測(cè)蛋白濃度。取20μg 蛋白經(jīng)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白4℃封閉過(guò)夜，加抗ANXA2和抗βactin(Santa Cruz)－抗孵育4 h，于含有辣根過(guò)氧化物酶二抗中孵育1 h，ECL(Millipore，USA)顯色，用image J 軟件分析蛋白密度，根據(jù)蛋白信號(hào)強(qiáng)度(SI)，計(jì)算ANXA2 相對(duì)比值(RR)=SIANXA2/SIβ-actin。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 以Elivision 一步法免疫組化分析ANXA2 表達(dá)。肝組織甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片3μm、脫蠟，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉，高壓加熱法修復(fù)抗原，加ANXA2 抗體、二抗、鏈霉素抗生物素蛋白－ 過(guò)氧化酶、DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片。Olympus BX50 光學(xué)顯微鏡觀察、攝像，以0.01 mol/LPBS(pH 7.5)分別替代一抗、二抗作陰性對(duì)照。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 以人ANXA2 ELISA 試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)檢測(cè)血ANXA2 濃度，100μl 血清或標(biāo)準(zhǔn)品加96 孔板，加100μl 檢測(cè)試劑A、B，然后加90μl 底物，最后加50μl 終止液并讀取450 nm 處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 肝ANXA2 表達(dá)的免疫組化分析 自身配對(duì)30例肝癌及癌旁、遠(yuǎn)癌組織中，ANXA2 蛋白表達(dá)與細(xì)胞定位見(jiàn)圖1。ANXA2 表達(dá)陽(yáng)性率，PHC組為100%(30/30)、癌旁組為90%(27/30)、遠(yuǎn)癌組為0 (0/30)。癌組與癌周組間陽(yáng)性率未見(jiàn)明顯差異(χ2=3.518，P＞0.05)，但組間ANXA2 表達(dá)強(qiáng)度，癌組明顯高于癌旁組(Z=6.113，P＜0.01)或遠(yuǎn)癌組(Z=7.328，P＜0.01)。肝組織ANXA2 表達(dá)分布存在差異，癌組定位于胞漿和胞膜，癌旁組于胞漿，遠(yuǎn)癌組中未見(jiàn)表達(dá)。

圖1 肝癌、癌周及遠(yuǎn)癌組織ANXA2 表達(dá)的免疫組化分析(200×) A:肝癌組織;B:癌周組織;C:遠(yuǎn)癌組織Fig 1 Immunohistochemistry of hepatic ANXA2 expression and distribution A:HCC tissues;B:Adjacent cancerous tissues;C:Distant cancerous tissues

2.2 肝ANXA2 表達(dá)Western blotting 分析 肝癌及自身配對(duì)癌旁、遠(yuǎn)癌組織(n=30)中，ANXA2 蛋白表達(dá)的Western blotting 分析結(jié)果見(jiàn)圖2A，各區(qū)帶經(jīng)掃描相對(duì)定量，肝組織ANXA2 表達(dá)與β-actin的比率見(jiàn)圖2B，可見(jiàn)肝癌組ANXA2 表達(dá)明顯高于癌旁、遠(yuǎn)癌組(F=498.221，P＜0.001)。

2.3 肝組織ANXA2 mRNA 定量分析 肝癌及自身配對(duì)癌旁、遠(yuǎn)癌組織中ANXA2 mRNA 表達(dá)的熒光定量PCR 分析見(jiàn)表1。肝癌組ANXA2 mRNA 過(guò)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)CtANXA2與Ctβ-actin值明顯高于癌旁組或遠(yuǎn)癌組(P＜0.001)。

2.4 血ANXA2 水平對(duì)肝癌診斷與鑒別價(jià)值 肝病患者血ANXA2 表達(dá)水平(ng/ml)的比較如圖3 所示。PHC組明顯高于良性肝病各組(P＜0.001)，肝硬化組(LC)明顯高于慢性肝炎組(CH)、急性肝炎組(AH)和正常對(duì)照組(NC)(P＜0.001)。肝癌ANXA2表達(dá)的病理學(xué)特征顯示:HBsAg 陽(yáng)性、伴肝外轉(zhuǎn)移和伴門(mén)靜脈癌栓組ANXA2的表達(dá)，明顯高于HBsAg 陰性組(t=6.820，P＜0.001)、不伴肝外轉(zhuǎn)移組(t=3.191，P=0.002)和不伴門(mén)靜脈癌栓組(t=2.859，P=0.005);肝癌低分化組、中等分化組ANXA 2 表達(dá)均顯著高于高分化組(P＜0.001);TNM 分期顯示，肝癌Ⅲ～Ⅳ期顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(t=5.594，P＜0.001);另性別、年齡(≥50歲)、腫瘤大小(＞5 cm)和血AFP(＞400 ng/ml)的組間未見(jiàn)明顯差異。

圖2 肝癌、癌周及遠(yuǎn)癌組織ANXA2 表達(dá)的Western blotting分析 A:Western blotting 分析;B:ANXA2 與β-actin 比率Fig 2 ANXA2 protein level in liver tissue of the patients with hepatocellular carcinoma A:Representative images of western blotting;B:Ratio (ANXA2/β-actin)

表1 肝癌、癌周及遠(yuǎn)癌組織ANXA2 mRNA 相對(duì)定量分析()Tab 1 Relative quantity of hepatic AXNA2 mRNA in hepatocellular carcinoma，adjacent，and distant-cancerous tissues ()

表1 肝癌、癌周及遠(yuǎn)癌組織ANXA2 mRNA 相對(duì)定量分析()Tab 1 Relative quantity of hepatic AXNA2 mRNA in hepatocellular carcinoma，adjacent，and distant-cancerous tissues ()

注:與癌灶組比較，* P＜0.001。

圖3 良、惡性肝病患者外周血ANXA2 表達(dá)水平檢測(cè)與比較Fig 3 Comparation of serum ANXA2 levels in the patients with liver diseases

2.5 血ANXA2 與AFP 聯(lián)合診斷PHC 如以血ANXA2 濃度≥18 ng/ml、AFP≥50 ng/ml為異常，血ANXA2和AFP 表達(dá)水平對(duì)PHC 診斷價(jià)值和聯(lián)合診斷價(jià)值的評(píng)估見(jiàn)表2。單一血ANXA2 診斷肝癌的敏感度為87.0%，與AFP 聯(lián)合診斷肝癌靈敏性增至96.5%，陰性預(yù)測(cè)值為96.6%。

表2 外周血ANXA2 與/或AFP 診斷PHC的效果比較(%)Tab 2 Eficiency evaluation of serum ANXA2 or/and AFP levels for hepatocellular carcinoma diagnosis (%)

3 討論

PHC 發(fā)生發(fā)展是由病毒、化學(xué)致癌物等多病因作用，涉及到癌基因或癌相關(guān)基因激活、抑癌基因失活及(或)胚胎期某些酶基因重新復(fù)活等，經(jīng)啟動(dòng)、促進(jìn)、演變多階段的發(fā)病過(guò)程，其中與基因調(diào)控、生長(zhǎng)因子激活等密切相關(guān)［2］。PHC 預(yù)后很差，因而早期診斷顯得極其重要。盡管AFP 是PHC 診斷和監(jiān)測(cè)的有用標(biāo)志物，但對(duì)小肝癌的假陰性率高達(dá)40%。最近ANXA2表達(dá)上調(diào)，可能是PHC 診斷具有應(yīng)用前景的標(biāo)志物［6］。本文比較了PHC組織中ANXA2 表達(dá)，分析ANXA2 表達(dá)病理特征。免疫組化顯示ANXA2 在癌組織定位于胞漿和胞膜，癌旁定位于胞漿，遠(yuǎn)癌組織未見(jiàn)明顯表達(dá)。癌組織中無(wú)論在ANXA2 蛋白或是mRNA水平，均明顯高于自身配對(duì)的癌旁或遠(yuǎn)癌組織，提示ANXA2 參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。

多基因異常參與PHC的形成和多階段的發(fā)展過(guò)程，已報(bào)道的與診斷相關(guān)的標(biāo)志物眾多，但具特異價(jià)值的不多，單純以AFP 診斷肝癌，敏感性和特異性均難以令人滿(mǎn)意［7］。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等新技術(shù)進(jìn)展和肝癌相關(guān)信號(hào)通路的闡明，愈來(lái)愈多肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，為肝癌診斷、監(jiān)測(cè)和治療帶來(lái)新的契機(jī)［8-10］。肝病患者血ANXA2 水平如臨界值為≥18 ng/ml，PHC患者陽(yáng)性率為87%，明顯高于肝硬化組(31.6%)和未見(jiàn)過(guò)表達(dá)的慢性肝炎組、急性肝炎組和正常對(duì)照組。AFP為PHC診斷臨床常用標(biāo)記物，在肝硬化、慢性肝炎中均有表達(dá)，而ANXA2 除PHC 過(guò)表達(dá)和部分肝硬化低表達(dá)外，其他肝病患者未見(jiàn)表達(dá)，表明ANXA2的診斷價(jià)值不亞于AFP。

ANXA2 在HBV 或者HCV 相關(guān)PHC中表達(dá)上調(diào)。ANXA2 通過(guò)tPA 依賴(lài)?yán)w溶酶產(chǎn)生誘導(dǎo)了細(xì)胞遷移和血管新生，代表腫瘤轉(zhuǎn)移潛能，促進(jìn)了PHC 細(xì)胞侵襲和遷移。且酪氨酸23 磷酸化依賴(lài)的ANXA2 細(xì)胞表面定位是侵襲和轉(zhuǎn)移所必須的。PHC組織ANXA2過(guò)表達(dá)，也可與細(xì)胞表面的纖溶酶原和組織纖溶酶原激活物結(jié)合，誘導(dǎo)纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶的激活和胞外基質(zhì)成分的降解［11］。PHC患者血ANXA2 表達(dá)的病理學(xué)特征，顯示ANXA2 表達(dá)不僅與PHC 侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］，還與HBV 感染、肝外轉(zhuǎn)移、門(mén)靜脈癌栓、分化程度和TNM 分期有關(guān)，但與腫瘤大小和AFP 水平間未見(jiàn)明顯相關(guān)。血ANXA2 或/與AFP對(duì)PHC 診斷具有互補(bǔ)診斷效率，表明血ANXA2 檢測(cè)具較高敏感性、準(zhǔn)確性和陰性預(yù)測(cè)值，聯(lián)合分析有助于PHC 診斷，也將助于探討肝癌發(fā)病機(jī)制，近1/3 肝硬化患者中ANXA2表達(dá)處臨界狀態(tài)，是否可作為肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的早期標(biāo)志或是否可成為肝癌基因治療的靶目標(biāo)有待研究［13］。

［1］El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma［J］.N Engl J Med，2011，365(12):1118-1127.

［2］van Malenstein H，van Pelt J，Verslype C.Molecular classification of hepato-cellular carcinoma anno 2011［J］.Eur J Cancer，2011，47(12):1789-1797.

［3］Lokman NA，Ween MP，Oehler MK，et al.The role of annexin A2 in tumori-genesis and cancer progression ［J］.Cancer Microenviron，2011，4(2):199-208.

［4］Zheng L，F(xiàn)oley K，Huang L，et al.Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer ［J］.PLoS One，2011，6(4):e19390.

［5］Sun Y，Gao G，Cai J，et al.Annexin A2 is a discriminative serological candidate in early hepatocellular carcinoma ［J］.Carcinogenesis，2013，34(3):595-604

［6］Ministry of Health of the People’s Republic of China.Updated standards for the diagnosis and treatment of primary liver cancer［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20(6):419-426.中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì).原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.中華肝臟病雜志，2001，9(2):324.

［7］Longerich T，Haller MT，Mogler C，et al.Annexin A2 as a differential diagnostic marker of hepatocellular tumors ［J］.Pathol Res Pract，2011，207(1):8-14.

［8］Ohno Y，Izumi M，Kawamura T，et al.Annexin II represents metastatic potential in clear-cell renal cell carcinoma［J］.Br J Cancer，2009，101(2):287-294.

［9］Qian J，Yao D，Dong Z，et al.Characteristics of hepatic igf-ii expression and monitored levels of circulating igf-ii mRNA in metastasis of hepatocellular carcinoma［J］.Am J Clin Pathol，2010，134(5):799-806.

［10］Malaguarnera G，Giordano M，Paladina I，et al.Serum markers of hepatocellular carcinoma ［J］.Dig Dis Sci，2010，55 (10):2744-2755.

［11］Sharma M，Ownbey RT and Sharma MC.Breast cancer cell surface annexin II induces cell migration and neoangiogenesis via tPA dependent plasmin generation ［J］.Exp Mol Pathol，2010，88 (2):278-286.

［12］Zhang X，Liu S，Guo C，et al.The association of annexin A2 and cancers［J］.Clin Transl Oncol，2012，14(9):634-640.

［13］Babiychuk EB，Atanassoff AP，Monastyrskaya K，et al.The targeting of plasmalemmal ceramide to mitochondria during apoptosis ［J］.PLoS One，2011，6(8):e23706.