孫 彬，婁和強(qiáng)，姜 曌，呂洪飛

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)系葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物.該屬植物目前全世界已知有16種3變種，分布于我國南部、越南北部、韓國南部和日本.我國已知有14種3變種［1］，主要分布于陜西、云南、貴州、湖南、湖北、山東等省.絞股藍(lán)是一種國家衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物［2］，除了作為傳統(tǒng)中藥材治療高血壓、高血脂等心腦血管疾病外，絞股藍(lán)葉代茶飲也歷史悠久，長期飲用明顯具有增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、減緩衰老、降血壓、降血脂、預(yù)防癌癥等保健功效.因此，絞股藍(lán)加工成干品作為一款保健茶也是其主要的消費(fèi)形式.

支持向量機(jī)(SVM)是1988年首次由Vapnik［3］提出的，如徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)和多層感知器網(wǎng)絡(luò)一樣，可應(yīng)用于非線性回歸及模式分類.由于支持向量機(jī)在模式識別方面的出色表現(xiàn)，已成功應(yīng)用于手寫識別技術(shù)［4］、微粒鑒別技術(shù)［5］、面部識別技術(shù)［6］、植物分類［7］等方面，農(nóng)業(yè)與食品技術(shù)領(lǐng)域［8］也有所涉及.LIBSVM是臺灣大學(xué)林智仁等［9］開發(fā)設(shè)計(jì)的一個(gè)簡單、易于使用和快速有效的支持向量機(jī)非線性回歸與模式識別的軟件包，能極大地簡化支持向量機(jī)的應(yīng)用過程，因而在機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域頗受歡迎.在SVM模型的建立過程中，核函數(shù)的選擇和參數(shù)優(yōu)化直接影響模型的預(yù)測或者分類性能［10-11］.徑向基核函數(shù)(RBF)在支持向量機(jī)中的應(yīng)用最為廣泛［12］.在參數(shù)優(yōu)化方面，除了應(yīng)用最廣的網(wǎng)格參數(shù)尋優(yōu)法［13］，粒子群優(yōu)化算法［14］和遺傳優(yōu)化算法［15］也能顯著提高支持向量機(jī)的模型性能，達(dá)到模型參數(shù)的最佳選擇的目的.

本研究的目的是通過建立數(shù)學(xué)模型來預(yù)測不同提取溫度、時(shí)間和料液比下浸提絞股藍(lán)細(xì)粉所得提取液中總黃酮、總酚的含量及其抗氧化活性，并通過比較不同核函數(shù)及不同參數(shù)優(yōu)化算法下SVM模型的預(yù)測結(jié)果，尋求最佳的預(yù)測模型.本研究有助于優(yōu)化草本茶的提取條件，并為工業(yè)上提取草本活性物質(zhì)提供數(shù)學(xué)模型.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

市售絞股藍(lán)茶，產(chǎn)于中國陜西省平利縣的絞股藍(lán)良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP)生產(chǎn)基地，出產(chǎn)日期為2012年3月，在實(shí)驗(yàn)開始前置于零下20℃冰箱中密封保存.

1.2 提取過程和樣品制備

首先，將絞股藍(lán)茶研成細(xì)粉，過60目篩，棄粗存細(xì).每份絞股藍(lán)茶細(xì)粉稱取0.5 g左右置于三角燒瓶中，按不同料液比要求加入不同體積的蒸餾水，并用保鮮膜封口.設(shè)置 50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 和 100 ℃共11 個(gè)溫度水平水浴加熱，每5 min震蕩搖勻1次.期間，按所要求的時(shí)間將相應(yīng)的材料從水浴中取出，并及時(shí)用15℃冷水冷卻，在室溫下抽濾，收集濾液定容于50 mL容量瓶中，即得待測樣品溶液.為了防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)損失，提取液在分析完成之前均在4℃下保存.

1.3 總黃酮含量的測定

絞股藍(lán)中總黃酮含量參考Bonvehi等［16］的比色法測定.取0.1 mL新鮮制備的絞股藍(lán)茶浸提液，加入1.5 mL 甲醇，0.1 mL 20 g/L 氯化鋁水溶液，0.1 mL 1 mol/L乙酸鉀水溶液和3.2 mL蒸餾水，混勻，于室溫放置30 min后，在415 nm波長下測定吸光度.按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中的總黃酮濃度，最后以每1 g絞股藍(lán)茶中含有蘆丁的毫克數(shù)表示絞股藍(lán)茶中的總黃酮含量(單位:mg/g).

1.4 總酚含量的測定

參考Emmons等［17］使用的福林酚比色法測定絞股藍(lán)茶浸提液中的總酚含量.具體步驟如下:取0.1 mL制備不久的提取液，加入8.7 mL蒸餾水，0.5 mL 福林酚試劑和0.7 mL 200 g/L Na2CO3溶液，混勻，于40℃水浴鍋中反應(yīng)40 min后，在波長755 nm處測定吸光度.按沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中的總酚濃度，最后以每1 g絞股藍(lán)茶中含有沒食子酸的毫克數(shù)表示絞股藍(lán)茶中的總酚含量(單位:mg/g).

1.5 自由基清除能力的測定

絞股藍(lán)茶浸提液的自由基清除能力以2，2'-二苯基-1-三硝基笨肼自由基(DPPH)的清除量來計(jì)算.操作步驟參考文獻(xiàn)［18］:取0.1 mL絞股藍(lán)茶浸提液，加入0.03 g/L DPPH甲醇溶液10 mL，封口搖勻，于黑暗中反應(yīng)30 min后，在波長517 nm處測定吸光度.絞股藍(lán)茶浸提液的自由基清除能力按如下公式計(jì)算:

自由基清除能力 =

r2=0.999 6.其中:A0為DPPH溶液黑暗中靜置30 min后的吸光度;A1代表絞股藍(lán)茶浸提液與DPPH溶液于暗處反應(yīng)30 min后的吸光度;As代表浸取液本身的吸光值;自由基清除能力的單位為 μmol/g.

標(biāo)準(zhǔn)曲線由生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液測得.

1.6 支持向量機(jī)分析

LIBSVM軟件包中集成了C-SVC(應(yīng)用于模式分類)，nu-SVC(應(yīng)用于模式分類)，one-class-SVM(應(yīng)用于模式識別)，epsilon-SVR(應(yīng)用于非線性回歸)和nu-SVR(應(yīng)用于非線性回歸)模型，其中C-SVC為默認(rèn)選擇模型.本研究內(nèi)容均基于LIBSVM(3.12版)中的 epsilon-SVR 模型，通過Matlab(7.9.0.529版本，R2009b)實(shí)現(xiàn).以下是 epsilon-SVR模型介紹:

Vapnik［3］于 1988 年提出，與大多數(shù)線性回歸模型類似，例如最小二乘法，支持向量機(jī)的目的也是尋求一個(gè)數(shù)學(xué)模型

式(3)中，ω和b分別是權(quán)值向量和偏移量.

給定一個(gè)數(shù)據(jù)集(xi，yi)，xi為輸入向量，yi為xi相應(yīng)的輸出向量，模型(3)的參數(shù)最終通過最小化下式來確定:

式(4)中:n 是樣本量;ξi和分別代表訓(xùn)練誤差的上限和下限;常數(shù)項(xiàng)C(懲罰參數(shù)，C＞0)決定了模型f(x)和差異大于容忍度ε的樣本數(shù)量之間的平衡［19］.

在給定的式(4)和式(5)中定義的模型優(yōu)化函數(shù)可以通過拉格朗日乘子法轉(zhuǎn)化為以下形式表現(xiàn):

式(6)中:ai和(且≥0，≥C)為拉格朗日乘子;K(xi，xj)則被定義為核函數(shù)［20-21］，而核函數(shù)有多個(gè)選擇.因此，要使非線性向量集映射到一個(gè)線性回歸的多維空間中，選擇一個(gè)合適與否的核函數(shù)決定了其回歸性能的優(yōu)劣［22］.在LIBSVM軟件包中集成了4種基本的常見的核函數(shù)，列舉如下:

1)線性核函數(shù):

2)多項(xiàng)式核函數(shù):

3)徑向基核函數(shù):

4)雙曲線核函數(shù):

徑向基核函數(shù)(RBF)是一個(gè)高斯函數(shù)，在4個(gè)核函數(shù)中應(yīng)用最多.其中，在式(8)和式(10)中，本研究只涉及其默認(rèn)參數(shù)，即coef 0=0.

支持向量機(jī)模型的預(yù)測性能是通過比較均方誤差(MSE)及平方相關(guān)系數(shù)(r2)決定的，兩者計(jì)算公式如下:

式(11)和式(12)中:n表示樣本數(shù)量;f(xi)表示xi通過SVM模型所得的預(yù)測值;yi是真實(shí)值.在模型中作為輸入和輸出的數(shù)據(jù)均先歸一化處理.

為了提高模型預(yù)測的精準(zhǔn)度，優(yōu)化核函數(shù)參數(shù)g和懲罰參數(shù)C是必不可少的.然而，目前并沒有國際公認(rèn)的模型參數(shù)優(yōu)化方法.本文運(yùn)用了最為廣泛使用的網(wǎng)格參數(shù)尋優(yōu)法.首先，將一對初始參數(shù)(C，g)代入模型中;然后，訓(xùn)練集被隨機(jī)分配到k個(gè)相互排斥的大小相近的子集中;接著，模型用其中k-1個(gè)子集作為訓(xùn)練集，剩余的1個(gè)子集作為測試集，該過程重復(fù)k次，直至每個(gè)子集均作為測試集出現(xiàn)，記錄下此過程中產(chǎn)生的最佳及平均交互驗(yàn)證均方誤差(CV-MSE);最后，大量不同的(C，g)參數(shù)被代入模型重復(fù)進(jìn)行以上步驟，選取均方誤差最小的(C，g)值作為最佳模型參數(shù)［23］.

除了網(wǎng)格參數(shù)尋優(yōu)法外，本研究也嘗試了另外2種啟發(fā)式算法:遺傳優(yōu)化算法(GA)和粒子群優(yōu)化算法(PSO).

遺傳優(yōu)化算法基于自然界進(jìn)化演變的原理，最早由 Goldberg 等［24］引入，后經(jīng) Holland［25］證實(shí).遺傳優(yōu)化算法是可以在復(fù)雜多維度搜索空間中尋求全局最優(yōu)解決方案的參數(shù)優(yōu)化算法.在遺傳優(yōu)化算法步驟中，尋找最優(yōu)解是從一個(gè)初始化的潛在解決方案開始的，記為一個(gè)種群，而每一個(gè)種群則由一定數(shù)目的個(gè)體組成.因此，在第一代種群產(chǎn)生后，以優(yōu)勝劣汰、適者生存的原理逐代演化產(chǎn)生越來越好的近似解.在每一代，根據(jù)問題域中個(gè)體適應(yīng)度的大小選擇個(gè)體，并通過遺傳學(xué)的遺傳算子進(jìn)行選擇、交叉和變異，產(chǎn)生出新的更優(yōu)化的種群.最后，末代種群中的最優(yōu)個(gè)體即是問題的最優(yōu)解.

粒子群優(yōu)化算法是1995年Kennedy和Eberhart［26］首次提出的，源于對鳥類捕食行為的研究.每個(gè)粒子都代表機(jī)制優(yōu)化問題的一個(gè)潛在最優(yōu)解，用速度、位置和適應(yīng)度3個(gè)指標(biāo)表示該例子的特征.適應(yīng)度由適應(yīng)度函數(shù)計(jì)算得到.Pbest被定義為一個(gè)搜索到最佳位置的粒子，即具有最佳適應(yīng)度;而Gbest則是所有粒子均搜索到最佳位置上，即均具備最佳適應(yīng)度.每個(gè)粒子都會朝著各自的最優(yōu)位置移動(dòng)，而全局的最優(yōu)解則由粒子群中所有粒子搜索到的最佳位置決定［27］.粒子的位置更新是通過自己現(xiàn)有的位置及速度計(jì)算的.速度算法如下所示:

式(13)和式(14)中:pi，d表示編號為 i的搜索到最佳位置的粒子;pg，d表示目前所有粒子處于全局最佳位置;t表示迭代次數(shù);r1和r2表示2個(gè)范圍在［0，1］的隨機(jī)數(shù)函數(shù);c1和c2為非負(fù)常數(shù)，稱為加速因子;w為慣性權(quán)重，首次被文獻(xiàn)［28］引進(jìn)，用以平衡局部運(yùn)算和全局運(yùn)算;速度被限制在［-vmax，vmax］范圍內(nèi)，vmax是由當(dāng)前和目標(biāo)位置決定的邊界值.綜上所述，每個(gè)粒子的新位置由下式計(jì)算得到:

2 結(jié) 果

2.1 浸提結(jié)果分析

提取工藝可以被諸多因素優(yōu)化，如提取時(shí)間［29-30］、提取溫度［31-32］、料液比、提取溶液類型［33］和其他輔助技術(shù)［30］.水提取由于其簡單性和運(yùn)營成本低，一直是生產(chǎn)工藝中使用最多的方法，一般國內(nèi)植物性飲品的制作也都是基于水提取.目前，已有研究人員研究了草本提取物中的營養(yǎng)成分和抗氧化活性［34-35］.支持向量機(jī)在食品科學(xué)領(lǐng)域已有大量應(yīng)用，如:棗干的分類［36］、蛋白含量預(yù)測［37］、水果表面損傷檢測［38-39］等.從現(xiàn)有的研究報(bào)道來看，本文通過SVM模型預(yù)測絞股藍(lán)浸提液中生物活性成分含量的研究尚屬首次.本研究的目的是為了論證支持向量機(jī)具有預(yù)測不同提取條件下浸提液中有效成分含量的潛力.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，隨著浸提時(shí)間、浸提溫度的增加，絞股藍(lán)茶浸提液中總酚含量、總黃酮含量及其清除自由基的能力總體上均有上升趨勢.浸提溫度越高，浸提液中各項(xiàng)指標(biāo)升高得越快.

圖1 不同浸提溫度及浸提時(shí)間下股藍(lán)浸提液中的總酚含量(料液比為1∶30)

從圖2可知，自由基清除能力與總黃酮含量、總酚含量密切相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)分別為0.941 6和0.931 5.有關(guān)抗氧化活性與酚類物質(zhì)含量相關(guān)性的類似研究已有蔬菜［40］和藥用植物［41］方面的報(bào)道.

圖2 絞股藍(lán)浸提液中總黃酮含量及總酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性

2.2 不同核函數(shù)對預(yù)測結(jié)果的影響

本實(shí)驗(yàn)中，以絞股藍(lán)茶的浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比作為輸入向量，所得的浸提液中總黃酮含量和總酚含量及其自由基清除能力作為輸出向量，建立了3個(gè)數(shù)學(xué)模型，用以分別預(yù)測絞股藍(lán)浸提液中的總黃酮含量、總酚含量及其自由基清除能力.如表1所示，本實(shí)驗(yàn)涉及了11個(gè)不同的提取溫度，每個(gè)溫度下共設(shè)置了5個(gè)提取時(shí)間及3個(gè)不同的料液比.因此，每個(gè)模型均有165個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其中隨機(jī)選擇120/165個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)組成訓(xùn)練集，其余的45/165個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)組成測試集.

如“材料與方法”部分所闡述的，選擇一個(gè)合適的核函數(shù)是建立SVM模型的關(guān)鍵.本研究中最佳核函數(shù)的選擇是通過比較模型在各自核函數(shù)下計(jì)算得到的相關(guān)系數(shù)和均方誤差來進(jìn)行的.因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試了幾個(gè)不同項(xiàng)數(shù)的多項(xiàng)式函數(shù)和4個(gè)基本核函數(shù)分別構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型.表2是不同項(xiàng)數(shù)參數(shù)下的多項(xiàng)式核函數(shù)SVM模型的預(yù)測結(jié)果，其中多項(xiàng)式模型中項(xiàng)數(shù)參數(shù)d的范圍為2～6;表3是在默認(rèn)參數(shù)下(C=0，g=0)，SVM模型對訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測結(jié)果.

表1 絞股藍(lán)茶浸提處理的溫度-時(shí)間組合

從表2和表3可知:當(dāng)d=2時(shí)，多項(xiàng)式核函數(shù)模型在預(yù)測總酚含量時(shí)達(dá)到最佳相關(guān)系數(shù);而雙曲線核函數(shù)下模型的預(yù)測結(jié)果最差，相關(guān)系數(shù)明顯小于其他核函數(shù)下模型的預(yù)測結(jié)果:預(yù)測總酚含量時(shí)測試集的相關(guān)系數(shù)僅為0.378 5;預(yù)測總黃酮含量時(shí)的相關(guān)系數(shù)為0.447 3;預(yù)測自由基清除能力時(shí)的相關(guān)系數(shù)為0.314 1，而其均方誤差卻比其他的預(yù)測結(jié)果大.圖3是SVM模型在不同核函數(shù)下預(yù)測絞股藍(lán)茶浸提液中總酚含量時(shí)訓(xùn)練集和測試集的結(jié)果.表3和圖3表明，徑向基核函數(shù)下SVM模型表現(xiàn)出最佳的預(yù)測精度，其測試集相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到了0.9396(預(yù)測總酚含量的結(jié)果)，0.926 9(預(yù)測總黃酮含量的結(jié)果)和0.921 9(預(yù)測自由基清除能力的結(jié)果).徑向基核函數(shù)的SVM模型不僅容易施行，而且能將非線性問題有效地映射到無限維空間達(dá)到回歸或模式識別的目的.因?yàn)?，徑向基函?shù)適合于處理非線性關(guān)系的問題［42］.

表2 默認(rèn)參數(shù)(C=0，g=0)下不同項(xiàng)數(shù)參數(shù)下的多項(xiàng)式核函數(shù)模型的預(yù)測結(jié)果

表3 默認(rèn)參數(shù)(C=0，g=0)下不同核函數(shù)SVM模型的預(yù)測結(jié)果

圖3 不同核函數(shù)SVM模型對絞股藍(lán)茶浸提液總酚含量預(yù)測的訓(xùn)練集和測試集的回歸結(jié)果

2.3 不同參數(shù)優(yōu)化方法對預(yù)測結(jié)果的影響

為了進(jìn)一步提高SVM模型的預(yù)測性能，參數(shù)優(yōu)化是必不可少的.以預(yù)測總酚含量為例，不同參數(shù)優(yōu)化算法下徑向基核函數(shù)SVM模型的預(yù)測結(jié)果如圖4所示.其中:圖4(a)是通過網(wǎng)格優(yōu)化算法優(yōu)化參數(shù)得到的優(yōu)化曲面;而圖4(b)和圖4(c)分別是由粒子群優(yōu)化算法和遺傳優(yōu)化算法得到的均方誤差(MSE)曲線.在粒子群優(yōu)化算法下粒子系數(shù)設(shè)為20，迭代次數(shù)為100;遺傳優(yōu)化算法下種群大小設(shè)為20，進(jìn)化代數(shù)值是100.

圖4 不同參數(shù)優(yōu)化算法下徑向基核函數(shù)SVM模型對絞股藍(lán)浸提液總酚含量的參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

圖5 不同算法參數(shù)優(yōu)化后徑向基核函數(shù)SVM模型對絞股藍(lán)浸提液總酚含量預(yù)測的訓(xùn)練集和測試集回歸結(jié)果

表4 不同參數(shù)優(yōu)化算法下徑向基核函數(shù)SVM模型的預(yù)測結(jié)果

圖5為不同的參數(shù)優(yōu)化方法下徑向基核函數(shù)SVM模型預(yù)測絞股藍(lán)提取液中總酚含量的訓(xùn)練集和測試集的回歸結(jié)果.由表4可知，粒子群優(yōu)化算法下徑向基核函數(shù)SVM模型獲得的測試集相關(guān)系數(shù)方面達(dá)到了最佳效果:預(yù)測總酚含量的相關(guān)系數(shù)為0.962 8，預(yù)測總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)為0.979 7，預(yù)測自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.951 3.通過比較圖3(c)和圖5可知，參數(shù)優(yōu)化可增加SVM模型的預(yù)測精度.在粒子群算法優(yōu)化參數(shù)后，SVM模型預(yù)測總酚含量的測試集相關(guān)系數(shù)從0.939 6上升到0.962 8，預(yù)測總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)從0.926 9上升到0.979 7，預(yù)測自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)從0.921 9上升到0.951 3.此外，網(wǎng)格參數(shù)優(yōu)化法下SVM模型預(yù)測總酚含量、總黃酮含量及自由基清除能力的測試集相關(guān)系數(shù)分別提高到了 0.957 2，0.977 9 和 0.917 0.遺傳算法優(yōu)化下SVM模型預(yù)測總酚含量、總黃酮含量及自由基清除能力的測試集相關(guān)系數(shù)分別提高到了 0.961 9，0.954 9 和0.942 3.

雖然3種參數(shù)優(yōu)化方法下的預(yù)測結(jié)果無顯著性差異［43］，但如表4所示，通過比較訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測結(jié)果，表明粒子群優(yōu)化算法比其他2個(gè)算法具有更好的泛化能力.粒子群優(yōu)化算法不僅在優(yōu)化SVM模型中表現(xiàn)突出，在模糊云分類器［44］中的應(yīng)用效果也十分明顯.因此，通過粒子群優(yōu)化算法優(yōu)化的SVM預(yù)測模型可以憑借網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)簡單、收斂速度快、泛化能力強(qiáng)的特點(diǎn)而建立一個(gè)良好的數(shù)學(xué)模型.本研究結(jié)果表明，SVM模型不僅可以預(yù)測絞股藍(lán)茶浸提液中的總酚、總黃酮等活性物質(zhì)的含量及浸提液清除自由基的能力，而且獲得了較為精確的預(yù)測結(jié)果.

3 討論與小結(jié)

本研究通過SVM模型成功預(yù)測了絞股藍(lán)水提取液中總酚和總黃酮的含量及其自由基清除能力.如表4所示，SVM模型的預(yù)測精度已達(dá)到了較高的水平，表明該模型可以用于預(yù)測絞股藍(lán)茶浸提液中的總酚、總黃酮等活性物質(zhì)的含量及浸提液的自由基清除能力.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議使用徑向基核函數(shù)并用粒子群優(yōu)化算法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化.SVM不僅可廣泛用于天然植物提取物中總酚、總黃酮等活性物質(zhì)的含量分析，也可推廣應(yīng)用于食品加工過程中營養(yǎng)物質(zhì)的控制.

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