賈 丹，劉 茹，劉明菲，黎玉彬，熊善柏,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(武漢)，湖北 武漢 430070)

我國是淡水魚漁業(yè)大國，2010年全國淡水魚總產(chǎn)量2225.6萬t，其中鳙魚產(chǎn)量達225.08萬t，居淡水魚產(chǎn)量的第3位[1]。我國南方地區(qū)居民素有用鳙魚頭煲湯的習(xí)慣，造成鳙魚頭價格較高，而去除魚頭后魚身的價格較低，將鳙魚肉加工成魚糜制品則可提高其經(jīng)濟價值[2]，但鳙魚糜較難形成凝膠且極易凝膠劣化[3]，如何改善魚糜制品的凝膠強度是鳙魚糜加工所面臨的主要問題。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)作為一種常見的凝膠增強劑，能催化肌球蛋白重鏈(myosin heavy chains，MHC)上賴氨酸的ε-氨基與谷氨酸的γ-羥酰胺基形成共價鍵而促進蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的共價交聯(lián)，從而提高魚糜制品的彈性和緊實度[4]，改善食品蛋白質(zhì)的流變學(xué)和黏合特性[5]。Téllez-Luis等[6]得出TGase可以提高低鹽重組鰱魚制品的質(zhì)構(gòu)特性和功能特性。陳海華等[7]證實TGase可以提高竹莢魚糜的凝膠強度、持水性及白度等特性，嚴菁[8]研究了TGase對鳙魚糜凝膠特性的影響并優(yōu)化其作用條件。周愛梅等[9]研究了TGase對鳙魚糜凝膠的凝膠強度、持水性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，但關(guān)于TGase對鳙魚糜熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中的蛋白質(zhì)的交聯(lián)、膠凝溫度(gelation temperature，Tgel)以及膠凝活化能(activation energy，Ea)的影響還未見報道。本實驗以鳙魚糜為對象，采用動態(tài)流變儀、物性分析儀、SDS-PAGE以及蛋白質(zhì)溶解性分析等方法，研究TGase熱誘導(dǎo)鳙魚糜凝膠形成過程中蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度、膠凝溫度和膠凝活化能，揭示TGase對鳙魚糜熱誘導(dǎo)膠凝特性的影響，為開發(fā)高品質(zhì)魚糜制品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鳙魚(Aristichthys nobilis)購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場，每尾體質(zhì)量為1500g左右。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(酶活力100U/g) 江蘇泰興一鳴精細化工有限公司；PVDC塑料腸衣 武漢飄飄食品集團有限公司；Fermentas蛋白標(biāo)樣 武漢谷歌生物科技有限公司；樣品緩沖液 武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XTPlus物性分析儀 英國Stable Micro System公司；AR-2000ex動態(tài)流變儀 英國TA公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；Gel doc XR+Universal hood Ⅱ凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜凝膠的制備

新鮮鳙魚去頭、骨、內(nèi)臟后采肉，用5倍質(zhì)量的自來水漂洗2次，再用5倍0.5% NaCl溶液漂洗1次(室溫為25℃左右，漂洗過程中是用一部分冰代替同等質(zhì)量的水)，每次漂洗10min，稱取6份質(zhì)量為100g的漂洗魚糜(魚糜水分含量(83±0.5)%)，加入10g冰水?dāng)匕?min，加2.5g NaCl和TGase(添加量分別為0、9.36、18.72、28.08、37.44、46.80U/100g魚糜)斬拌2min(保證漂洗和斬拌過程溫度在0～10℃之間)，灌入直徑為20mm的腸衣，兩段式加熱冷卻后于4℃放置過夜。

1.3.2 魚糜動態(tài)流變學(xué)的測定

取一定量的魚糜置于載物臺與圓形平板(直徑為4cm)之間，去除過量的樣品，用液體石蠟封住樣品以免水分蒸發(fā)，載物臺與平板間距為1000μm。采用0.1Hz的振動頻率，剪切力為10Pa，從20℃加熱到90℃，升溫速率為1℃/min[10]，魚糜水分含量為(83±0.5)%，加酶量為0、9.36、18.72、28.08、37.44、46.80U/100g魚糜。

根據(jù)高分子物理學(xué)的觀點，Tgel可定義為聚合物在溫度掃描過程中儲能模量G′發(fā)生顯著變化時所對應(yīng)的溫度[11]。在40～70℃的范圍內(nèi)，G′和溫度之間可以用式(1)進行表述。對式(1)進行一階求導(dǎo)，可以得到G′最小值時對應(yīng)的溫度，即當(dāng)dG′/dT=0時對應(yīng)的溫度為Tgel[11]。

魚糜凝膠形成過程中的能壘可以用膠凝活化能Ea來表示，參考Yoon等[11]的方法，按照式(2)計算。

1.3.3 魚糜凝膠強度的測定

在室溫條件下將樣品切成20mm的小段，用TA-XTPlus物性分析儀進行凝膠強度的測試。采用P/0.25S球型探頭穿刺樣品，參數(shù)設(shè)置為：一次壓縮模式、壓縮距離15mm、測前速率1mm/s、測中速率1mm/s、測后速率10mm/s。每個樣品做6個平行，取平均值。穿刺曲線上的第1個峰即為破斷強度。凝膠強度為破斷強度與凹陷深度的乘積[8]。日本陸上冷凍魚糜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中AA級的凝膠強度為4400g·mm，A級的凝膠強度為3500g·mm[8]。

1.3.4 魚糜凝膠持水性能的測定

將樣品切成厚3mm的圓片(Φ=20mm)并稱質(zhì)量m1，用濾紙包裹，然后用硬度計加壓3kg并保持1min，去掉濾紙，再將樣品稱質(zhì)量m2[12]，按照式(3)計算失水率。

1.3.5 魚糜凝膠溶解度的測定

稱取1g魚糜樣品溶解于20mL 20mmol/L Tris-HCl(含1g/100mL SDS、8mmol/L尿素和體積分數(shù)2% β-巰基乙醇，pH8.0)緩沖液，均質(zhì)，混合液于100℃加熱2min后，于室溫攪拌4h，10000×g離心30min。取上清液10mL，添加50g/100mL冷的三氯乙酸(TCA)至終含量為10%，混合液于4℃放置18h，10000×g離心3min，沉淀物用10g/100mL TCA沖洗并溶解于0.5mol/L NaOH中。蛋白質(zhì)含量用Lowry法[13]測定。溶解度表示為樣品在溶劑中測得的蛋白質(zhì)總量占總蛋白(凝膠直接溶解于0.5mol/L NaOH)含量的百分比[14]。

1.3.6 SDS-PAGE電流

肉糜樣品的處理參考Benjakul等[15]的方法。取3g肉糜加入5g/100mL SDS后采用高速分散均質(zhì)機均質(zhì)，再于85℃的水浴中保溫1h溶解樣品中的蛋白質(zhì)，隨后在8000r/min離心20min取上清液，并用Lowry法[13]測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度為0.5～2mg/mL。取稀釋后蛋白樣品0.5mL，加入0.1mL的樣品緩沖液，沸水煮10min，冷卻后取10μL上樣于5%的濃縮膠上，在7.5%分離膠上進行電泳分離，以考馬斯亮藍G250染色1h，用醋酸、乙醇體積比1：1進行脫色[16]。用凝膠成像儀照相，采用Image Lab分析MHC條帶強度的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SAS8.0分析數(shù)據(jù)，采用Duncan新復(fù)極差多重比較對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase對鳙魚糜熱膠凝過程中動態(tài)流變性能的影響

2.1.1 TGase對鳙魚糜熱膠凝過程中儲能模量的影響

圖 1 不同TGase添加量對鳙魚糜G′的影響Fig.1 Changes in G' of surimi from bighead carp at various TGase concentrations

圖 2 不同TGase添加量的鳙魚糜G′隨溫度變化的阿倫尼烏斯曲線(n=2)Fig.2 Arrhenius plots for the changes in G' of bighead surimi at various TGase concentrations (n=2)

儲能模量G′反映黏彈性物質(zhì)的類固體特性即彈性[17]。由圖1、2可知，鳙魚糜凝膠形成過程大致可分為3個階段：在20～38℃范圍，TGase的添加使G′有小幅度增加，不同TGase添加量的鳙魚糜在37℃附近均出現(xiàn)1個小峰，G′隨著加酶量的增加而增大，但是當(dāng)TGase添加量超過28.08U/100g魚糜時，G′下降。在20～38℃范圍，肌球蛋白的輕鏈發(fā)生解離，在TGase作用下蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，使體系的G′增加[18]。在39～47℃范圍，隨著溫度的升高鳙魚糜的G′迅速下降，其原因可能是溫度升高破壞了以氫鍵為主的低溫凝膠化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[19]，也有可能是魚糜中內(nèi)源性蛋白酶水解肌球蛋白，導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)的破壞[19]。當(dāng)酶添加量超過9.36U/100g魚糜時，其G′的下降程度明顯減弱。在48～90℃范圍，隨著溫度升高G′大幅度增加；隨著TGase用量增加，鳙魚糜的G′顯著增加，在TGase添加量為28.08U/100g魚糜時，G′達到最大，繼續(xù)增加酶量，G′則會明顯下降，但都高于未添加TGase的鳙魚糜組，其原因是魚糜中蛋白質(zhì)除了以二硫鍵和疏水相互作用等形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[18]外，TGase催化MHC形成ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵在魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)形成過程中起主導(dǎo)作用，從而促使了更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，但過量的TGase則不利于谷氨酸與賴氨酸的共價交聯(lián)。在TGase添加量為28.08U/100g魚糜時，鳙魚糜的G′達到最大為17860Pa，較對照組的G′提高了2.5倍。

2.1.2 TGase對鳙魚糜熱膠凝溫度的影響

表 1 不同TGase添加量的鳙魚糜G′隨溫度變化的擬合曲線方程的系數(shù)Table 1 Coefficients of polynominal equation of bighead surimi at various TGase concentrations

在溫度掃描過程中，采用式(1)對G′(40～70℃)進行擬合。由表1可知，鳙魚糜的Tgel為46.89℃，當(dāng)TGase的添加量為9.36U/100g魚糜時，Tgel為46.35℃，下降不明顯。在添加量為18.72U/100g魚糜時，鳙魚糜的Tgel為44.08℃，較未添加TGase的鳙魚糜降低了2.81℃。當(dāng)繼續(xù)增加酶量到46.80U/100g魚糜時，鳙魚糜的Tgel繼續(xù)下降但幅度不明顯，Tgel都在43℃以上?？傮w來說，在鳙魚糜中添加TGase可以降低魚糜的Tgel。在蛇鯔魚糜中，也發(fā)現(xiàn)添加TGase可使其膠凝溫度降低[20]。

在40～70℃的溫度范圍內(nèi)，魚糜的凝膠過程按二級反應(yīng)進行擬合，不同酶添加量的膠凝活化能如表2所示，擬合R2都在0.90以上，說明擬合效果較好。TGase的添加使得魚糜Tgel降低的同時Ea也下降。這可能是由于TGase交聯(lián)作用使得蛋白質(zhì)分子間的接觸概率增大，更容易產(chǎn)生分子鏈間的交聯(lián)，魚糜蛋白質(zhì)形成凝膠所需要克服的能壘變小，更容易形成凝膠[21]。

表 2 不同TGase添加量的鳙魚糜凝膠形成過程中的動力學(xué)參數(shù) Table 2 Kinetic gelation parameters of surimi from bighead carp at various TGase concentrations

2.2 TGase添加量對鳙魚糜凝膠強度的影響

表 3 TGase添加量對鳙魚糜凝膠強度的影響(±s，n=6)Table 3 Effect of TGase concentration on the gel strength of surimi gels from bighead carp (±s，n=6)

表 3 TGase添加量對鳙魚糜凝膠強度的影響(±s，n=6)Table 3 Effect of TGase concentration on the gel strength of surimi gels from bighead carp (±s，n=6)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P ＜0.05)。

加酶量/(U/100g魚糜)破斷強度/g凹陷深度/mm凝膠強度/(g·mm)0 386.13±13.02d7.97±0.54c3081.58±256.44d 9.36596.62±38.56c9.95±0.12a5943.00±459.97c 18.72772.31±22.33b8.76±0.05bc6767.28±157.48bc 28.08867.98±62.12a9.54±0.45ab8305.87±585.52a 37.44868.35±26.28a8.71±0.39bc7570.65±566.14ab 46.80786.06±11.49b9.07±0.33b7135.99±286.18abc

由表3可知，添加TGase可以顯著提高鳙魚糜的破斷強度、凹陷深度和凝膠強度(P＜0.05)。當(dāng)TGase的添加量小于28.08U/100g魚糜時，鳙魚糜的破斷強度和凝膠強度隨著TGase添加量的增加而增大。這是因為隨著加酶量的增加，鳙魚糜的Tgel降低、膠凝能壘減小，ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵形成得更多；但當(dāng)TGase超過28.08U/100g魚糜時，鳙魚糜凝膠強度反而會下降，因為過度的交聯(lián)作用使得鳙魚糜凝膠彈性降低而變得硬而脆，這和嚴菁等[22]的研究結(jié)果一致。但加酶后的魚糜凝膠強度整體較未添加TGase的魚糜的凝膠性能要好。在加酶量為28.08U/100g魚糜時，鳙魚糜凝膠強度達到最大，較未加酶的提高了約2.7倍。在紅杉魚糜(golden threadfi n-bream)和鱈魚糜(pollack surimi)中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象[23]。

2.3 TGase添加量對鳙魚糜凝膠持水性的影響

圖 3 TGase添加量對鳙魚糜凝膠失水率的影響Fig.3 Effect of TGase concentration on the expressible moisture of surimi gels from bighead carp

持水性用于表征蛋白質(zhì)結(jié)合水的能力，對于魚糜凝膠制品的加工特性、產(chǎn)量及成本起著重要的作用。凝膠失水率與持水性成負相關(guān)，失水率越小，凝膠持水性能越好。同時還與凝膠的結(jié)構(gòu)有關(guān)，形成的凝膠越致密、均勻則其失水率越低[24]。由圖3可知，TGase的添加使得魚糜凝膠壓出的水分明顯減少，這表明TGase的加入提高了魚糜凝膠的持水性。當(dāng)TGase添加量為28.08U/100g魚糜時，持水性達到最大，失水率較未添加TGase減少了46%。這可能是由于隨著TGase添加量繼續(xù)增加，TGase引起蛋白質(zhì)分子聚集，從而使魚糜凝膠持水性下降[25]。

2.4 TGase添加量對鳙魚糜凝膠溶解度及SDS-PAGE圖譜的影響

圖 4 TGase添加量對鳙魚糜凝膠溶解度的影響Fig.4 Effect of TGase concentration on the solubility of surimi gels from bighead carp

β-巰基乙醇、尿素及SDS可除去除ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵以外的其他化學(xué)鍵。因此魚糜凝膠溶解度與魚糜網(wǎng)絡(luò)中生成的ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵呈反比。由圖4可知，魚糜凝膠的溶解度隨著TGase添加量的增加而下降，這說明TGase催化形成了更多的ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵，這和前面動態(tài)流變得出的結(jié)論一致。加酶量為46.80U/100g魚糜時，溶解度下降約25%。但是過多的ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵會導(dǎo)致魚糜變得硬又脆，從而使魚糜的凝膠強度反而下降(表3)。加酶量對SDS-PAGE圖及肌球蛋白重鏈的條帶百分比的影響分別如圖5、6所示。添加TGase較未添加酶的魚糜凝膠的MHC的條帶強度顯著降低。由圖6可知，MHC條帶的百分比隨著加酶量的增加而降低，當(dāng)加酶量為28.08U/100g魚糜時，MHC條帶的百分比為9.3%，繼續(xù)增加酶量，其MHC條帶的百分比略微有些下降而后上升，但與加酶量為28.08U/100g魚糜時比較，MHC條帶百分比幾乎趨于不變。MHC條帶強度減弱是因為TGase使MHC之間通過ε-(γ-谷氨酰)-賴氨酸鍵發(fā)生共價交聯(lián)而形成了分子質(zhì)量更大的肽鏈，不易被β-巰基乙醇等離解[23]。在整個過程中肌動蛋白的條帶沒有改變，說明肌動蛋白沒有參與TGase催化的交聯(lián)作用。在TGase誘導(dǎo)牛肉蛋白形成凝膠的過程中，Dondero等[4]也發(fā)現(xiàn)了肌動蛋白沒有參與TGase催化牛肉蛋白的交聯(lián)作用這一現(xiàn)象。

圖 5 TGase處理的鳙魚糜凝膠SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of surimi gels from bighead carp subjected to TGase treatment

圖 6 TGase處理的鳙魚糜凝膠的MHC強度變化Fig.6 Changes in MHC intensity of surimi gels from bighead carp subjected to TGase treatment

3 結(jié) 論

鳙魚糜在熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中，其Tgel和Ea隨著TGase添加量的增加而降低，而溶解度和MHC條帶百分比隨著TGase添加量的增加先降低后趨于穩(wěn)定。說明添加TGase可降低魚糜膠凝所需的能壘、使MHC之間更易形成ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸共價鍵。而鳙魚糜凝膠的破斷強度、凝膠強度、持水性G′隨著酶量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)TGase添加量為28.08U/100g魚糜時，其凝膠強度最高、失水率最小。與對照組相比，添加28.08U/100g魚糜 TGase的鳙魚糜凝膠強度提高2.7倍、失水率減少46%、G′提高2.5倍。當(dāng)TGase添加量超過28.08U/100g魚糜，鳙魚糜凝膠的G′、破斷強度、凝膠強度和持水性下降。因此適當(dāng)添加TGase可降低鳙魚糜膠凝所需的Ea和Tgel，明顯提高鳙魚糜的凝膠強度和持水性。

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