楊 林，孫術(shù)國，羅 章,*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

1969年，美國科學(xué)家McCord等[1]從牛血紅細胞中首次分離超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，此后科學(xué)家對SOD研究作了大量的工作，研究發(fā)現(xiàn)SOD是一種以自由基為底物的酶，能快速有效清除過剩的超氧陰離子自由基，具有抗炎[2]、抗輻射[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]及提高機體自身免疫力[6]等功效，由于功能強大，使用廣泛，因而備受科學(xué)家關(guān)注。

動物血液富含SOD，西藏牦牛作為高原最為活躍的動物，其血液SOD在克服高原反應(yīng)，抗除疲勞方面發(fā)揮重要作用，然而牛血液成分復(fù)雜，給SOD分離和純化增添困難。分離純化SOD的研究已有不少報道，如張波等[7]采用沉淀、熱變、再沉淀獲SOD粗品，再經(jīng)DEAESephadex A-50柱層析，得到比活力為2325U/mg SOD。Fattman等[8]采用瓊脂糖層析來純化鼠肺細胞外SOD粗酶液。王保全[9]以牛血為原料，采用過溶血、熱變、丙酮沉淀、超濾濃縮等獲得SOD粗品，再經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾層析和DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析純化超濾后酶液，獲得比活力大于3000U/mg SOD。這些研究都需采用層析法對粗酶液進一步純化，層析法作為蛋白質(zhì)分離純化具有選擇性高、分離效果佳等優(yōu)點，但也具有對填料要求高、分離效率低、操作難度大等缺點。而磁性納米粒子作為一種新型的蛋白質(zhì)分離介質(zhì)，具有快速、分離效率高、操作簡單以及可重復(fù)使用等優(yōu)點[10-12]，本實驗采用Fe3O4磁性納米粒子從牦牛血液中分離純化SOD，研究磁性納米粒子對酶的吸附動力學(xué)以及影響SOD比活力和回收率的各種因素。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛血清超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、牛血清白蛋白(BSA) 美國Sigma-Aldrich公司。

六水三氯化鐵(分析級)、三水醋酸鈉(分析純)、乙二醇(分析純)、戊二醛(體積分數(shù)25%)和聚乙烯亞胺(質(zhì)量分數(shù)99%) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；SOD試劑盒 上海工碩生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析級。

JEM-1230透射電鏡儀 日本JEOL公司；Nicolet 5700智能傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；DU700紫外-可見光分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 磁性納米粒子的制備

稱取0.025g FeCl3·6H2O和1.2g乙酸鈉移入含有20mL乙二醇的燒杯中，室溫下磁力攪拌30min，混合均勻后，再添加0.5g 聚乙烯亞胺(PEI)，室溫下攪拌30min至溶液均勻透明，將攪拌好的混合物溶液倒入25mL的高壓反應(yīng)釜中，密封，并將反應(yīng)釜置于200℃電熱鼓風干燥箱當中，反應(yīng)12h，取出自然冷卻至室溫。將產(chǎn)物用雙蒸水洗滌數(shù)兩2次，再用無水乙醇洗滌2次，然后進行超聲波處理，接著再用雙蒸水洗滌1次，最終將納米粒子分散于20mL雙蒸水，裝入玻璃瓶，室溫保存，備用。

1.3 SOD粗酶液制備

制備SOD粗酶液參考王保全[9]改進傳統(tǒng)工藝提純SOD方法。獲得的SOD粗酶液冷凍干燥制成酶粗品，置于4℃保藏，備用。

1.4 磁性納米粒子分離純化SOD過程

首先將一定量SOD酶粗品溶于結(jié)合液(0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH6.5，含有NaCl濃度為0.5mol/L)，再將100mg的磁性納米粒子分散于結(jié)合液中，在4℃條件下輕輕攪拌2h，然后磁性分離，接著將吸附酶的磁性納米粒子分散在結(jié)合液(不含酶粗品)清洗兩次，最終將吸附酶的磁性納米粒子分散于20mL的解離液(0.05mol/L醋酸鹽緩沖溶液，pH 4.0)中，在4℃條件下輕輕攪拌30min，磁性分離，此過程重復(fù)一次，兩次獲得的解離液匯集，透析濃縮后冷凍干燥，最終SOD樣品置于4℃保藏。

為了研究結(jié)合液pH值對SOD的比活力和回收率影響，實驗設(shè)計結(jié)合液pH值分別為4.5、5.5、6.5、7.5和8.5；為了研究不同離子強度對SOD的比活力和回收率影響，結(jié)合液中NaCl濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/L；為了研究解離液pH值對SOD的比活力和回收率影響，將解離液pH值分別設(shè)定為4.0、4.5、5.0、5.5；為了研究吸附時間對SOD的比活力和回收率影響，吸附時間分別設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。為了研究不同酶粗品蛋白初始濃度對SOD吸附效果的影響，實驗設(shè)計酶粗品蛋白初始濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol/L。

1.5 磁性納米粒子表征

采用透射電鏡(TEM)觀察磁性納米粒子形貌。采用傅里葉紅外光譜(FTIR)分析磁性納米粒子吸附SOD前后紅外光譜圖的變化，掃描范圍500～4000cm-1，分辨率為4cm-1。

1.6 SOD比活力和回收率分析

SOD在每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量為一個活力單位(U)。酶活力計算見式(1)?？偟鞍缀扛鶕?jù)考馬斯亮藍G-250法測定[13]，以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì)。

式中：A0為參照液吸光度；A1為樣品吸光度；N1為反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)；N2樣品測試前的稀釋倍數(shù)；B為蛋白質(zhì)含量。

SOD比活力為SOD活力與分離純化后酶的質(zhì)量比值。

回收率為磁性納米粒子分離后總蛋白占酶粗品總蛋白的百分數(shù)。

1.7 SDS-PAGE分析

將12%聚丙烯酰胺凝膠用于SDS-PAGE測定 SOD 的純度。所用的分析條件為：5%濃縮膠，10%分離膠，濃縮膠電泳電壓80V，分離膠電壓 120V，電泳樣品用考馬斯亮藍G-250染色后再按照標準程序褪色[14]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

上述所有實驗重復(fù)3次，取平均值，實驗采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米粒子外貌、粒徑及表面化學(xué)性質(zhì)分析

2.1.1 磁性納米粒子外貌和粒徑

圖 1 表面包埋聚乙烯亞胺的磁性納米粒子的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of magnetic nanoparticles with surface-coated ethylene imine polymer

采用TEM表征磁性納米粒子，結(jié)果如圖1所示，用于酶分離純化的磁性納米粒子顆粒分散均勻，粒徑約為(35±5)nm，這些說明磁性納米粒子分散性好，穩(wěn)定性較佳。而SOD分子粒徑在2～4nm，磁性納米粒子表面可以同時吸附較多數(shù)量的SOD，同時也不會因為納米粒子粒徑太大，球表面曲率過高造成對蛋白吸附產(chǎn)生空間位阻，進而降低對蛋白的吸附。

2.1.2 磁性納米粒子表面化學(xué)性質(zhì)分析

圖 2 磁性納米粒子吸附蛋白前(B)后(C)及純SOD(A)的紅外光譜分析Fig.2 FTIR spectra of pure SOD (A), Fe3O4 magnetic nanoparticles (B) and magnetic nanoparticles with SOD (C)

FTIR可以用于分析磁性納米粒子表面活性基團，同時也能分析納米粒子吸附蛋白前后紅外光譜特征所發(fā)生的變化。結(jié)果如圖2所示，紅外光譜掃描圖(A)在1637.1cm-1和1648.5cm-1處出現(xiàn)最大吸收峰，為SOD蛋白質(zhì)酰胺Ι帶的紅外特征吸峰[15]；紅外光譜掃描圖(B)在553.5cm-1的紅外特征吸峰為Fe—O的振動，在3407.6cm-1有最大吸收峰，說明磁性納米粒子表面富含NH2基團(來自于聚乙烯亞胺)，這賦予了納米粒子表面可帶大量的正電荷。紅外光譜掃描圖(C)在570.8cm-1的紅外特征吸峰為Fe—O的振動，在1637.3cm-1和1648.9cm-1處出現(xiàn)最大吸收峰，這是蛋白質(zhì)酰胺Ι帶的紅外特征吸峰[15]，說明納米粒子已經(jīng)吸附SOD，同時也證明了SOD吸附到納米粒子表面過程，酶分子的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.2 結(jié)合液pH值對SOD比活力和回收率的影響

在磁性納米粒子吸附純SOD實驗當中，通過表面化學(xué)分析證實SOD已經(jīng)吸附到磁性納米粒子表面(2.1.2節(jié))?，F(xiàn)將磁性納米粒子分散在不同pH值的結(jié)合液(含適量的酶粗品)中，研究結(jié)合液pH值對SOD比活力和回收率的影響。結(jié)果如圖3A所示，結(jié)果表明：隨著pH值增大，磁性分離獲得的SOD比活力先增加，后急劇降低，而獲得的酶回收率在pH4.5～8.5始終呈增大趨勢。由于SOD在pH5.5～8.5穩(wěn)定性較好，磁性納米分離也是一種非常溫和的分離純化方式，因此，此分離純化過程對SOD酶活力損失較低。在pH8.5處，SOD比活力迅速降低和回收率增高，說明總蛋白的量增加，但SOD在總蛋白中占的比例下降，即獲得的SOD純度在pH4.5～7.5一直呈上升趨勢，在pH8.5則急劇下降，因此造成比活力也急劇降低?？赡艿脑蛟谟谂５腟OD的等電點(pI)在5.5左右，當pH值在6.0～7.5時，SOD表面帶負電荷，且負電荷的數(shù)量隨pH值的增大而增加，而磁性納米粒子表面帶有大量的正電荷，因此，電荷之間相互作用促進磁性納米粒子對SOD的吸附，同時也對牛血清白蛋白排斥(或者說不吸附)。但pH＞8.0時，由于雜蛋白也帶負電荷，致使納米粒子對雜蛋白的吸附，因而SOD純度降低，同時比活力降低，因此最佳結(jié)合液pH值為7.5。

圖 3 磷酸鹽緩沖溶液pH值(A)和NaCl濃度(B)、解析液pH值(C)以及吸附時間(D)對SOD比活力和回收率的影響Fig.3 The effects of pH of binding buffer (A), pH of dissociation buffer (C), NaCl concentration (B) and adsorption time (D) on the specifi c activity and recovery of SOD

2.3 NaCl濃度對SOD比活力和回收率的影響

對于蛋白質(zhì)分離純化，其分離體系中離子強度也是重要的影響因子。不同NaCl濃度對SOD比活力和回收率的影響結(jié)果如圖3B所示，結(jié)果表明隨離子強度的增加，SOD比活力變化不明顯，而SOD回收率先增加，然后迅速降低?？赡茉蛟谟诘碗x子強度促進一些蛋白的分散，有利于蛋白向磁性納米粒子靠近，但溶液體系離子強度過高，易導(dǎo)致納米粒子表面電荷和蛋白分子表面電荷產(chǎn)生屏蔽作用，因而阻止了納米粒子對蛋白分子的吸附[16]，造成SOD回收率降低，上述結(jié)果表明最佳NaCl濃度為0.5mol/L。

2.4 解離液pH值對SOD比活力和回收率的影響

將SOD從磁性納米粒子表面解離，一方面可以回收高比活力的SOD，另外可以重復(fù)使用磁性納米粒子，但解離液pH值不同，獲得的SOD比活力和回收率也各異，解離液pH值對SOD比活力和回收率影響如圖3C所示，結(jié)果表明，在pH4.0～5.5，SOD比活力隨pH值的增加而增大，而回收率隨pH值的增加而降低。可能原因在于當pH值為4.0，由于SOD帶正電荷，同種電荷相互排斥，促進SOD從磁性納米粒子解離下來，而pH值增加，SOD表面正電荷減少，因此，這種排斥降低，致使少量的SOD仍然保留在磁性納米粒子表面，因此回收率降低。同時，由于較低pH值易造成Zn2+從酶上脫落，SOD酶活性受到損失[17]，因此，在較低pH值解離，SOD比活力降低，綜合考慮SOD比活力和回收率，最佳的解離液pH值為5.0。

2.5 吸附時間對SOD比活力和回收率的影響

磁性納米粒子吸附溶液中蛋白質(zhì)是一個動態(tài)過程，從磁性納米粒子表面第一個吸附位點被蛋白占據(jù)到全部吸附位點被蛋白占據(jù)，需要一段時間，這段時間由磁性納米粒子與蛋白的相互作用力、磁性納米粒子分散密度、蛋白的濃度以及機械攪拌等因素決定，本實驗在上述因素都確定的情況下，研究吸附時間對SOD比活力和回收率的影響，結(jié)果如圖3D所示，結(jié)果表明：隨吸附時間的延長，SOD比活力變化不明顯，但其回收率呈上升趨勢，這說明磁性納米粒子對SOD吸附不斷增加，對雜蛋白的吸附很低甚至不吸附，因而最佳的吸附時間為2h。

2.6 磁性納米粒子對SOD吸附動力學(xué)研究

載體對目標蛋白的吸附作用可以采用吸附等溫線表征，而且，通過掌握等溫線相關(guān)參數(shù)，可以建立數(shù)學(xué)模型用于預(yù)測載體對目標蛋白的吸附規(guī)律。Langmuir吸附模型目前廣泛用于分離純化生物大分子過程[18-19]，其表達式如下：

等式(2)和(3)中q和C分別是蛋白的載荷/(mg/g)和水溶中蛋白的質(zhì)量濃度/(mg/mL)，Kd是解離常/(mg/mL)，qm是最大載荷/(mg/g)。

圖 4 酶粗品質(zhì)量濃度對SOD吸附效果的影響Fig.4 Effect of initial concentration of crude enzyme extract on SOD adsorption

如圖4所示，結(jié)果表明磁性納米粒子對SOD吸附很好的擬合Langmuir吸附模型(R2=0.98)，獲得磁性納米粒子對SOD最大的載荷為166.7mg/g，解離常數(shù)Kd為0.32mg/mL，高于Ma Zhiya等[20]報道的親和作用解離常數(shù)(Kd=0.14mg/mL)，說明這種依靠電荷之間的相互作用力低于親和作用相互作用力，同時隨酶粗品蛋白質(zhì)量濃度的增加，分離純化的SOD比活力變化不明顯，說明磁性納米粒子對酶粗品中蛋白的吸附主要是針對SOD的吸附，因此上述建立的數(shù)學(xué)模型本質(zhì)上是預(yù)測磁性納米粒子對SOD吸附作用。

2.7 SOD純度分析

為了進一步檢驗分離純化的SOD純度，并且對純化過程進行監(jiān)控，實驗采用SDS-PAGE對各階段的樣品進行分析，結(jié)果如圖5所示，泳道A是采用溶菌酶作為標品，泳道B是粗酶液樣品的電泳結(jié)果，結(jié)果表明粗酶液樣品的雜蛋白主要是牛血清白蛋白，分子質(zhì)量為66.43kD，采用磁性納米粒子分離純化的SOD，其電泳結(jié)果在C泳道，結(jié)果顯示泳道呈單一條帶，由于牦牛SOD為Cu/Zn-SOD，其分子質(zhì)量為32kD左右，為二聚體分子，在SDS-PAGE電泳過程中分離成單體，因此在16kD左右出現(xiàn)單條帶[21]，此結(jié)果證明獲得的SOD純度較高。

圖 5 磁性納米粒子吸附分離SOD的電泳表征 Fig.5 Separation of SOD from crude enzyme extract using magnetic nanoparticles

3 結(jié) 論

采用溶劑熱法制備Fe3O4磁性納米粒子，表面經(jīng)聚乙烯亞胺包埋，磁性納米粒子對SOD的吸附作用可以通過紅外光譜法證實。利用磁性納米粒子從粗酶液中直接分離純化SOD，結(jié)果表明磁性納米粒子對SOD的載荷和獲得的SOD純度受到粗酶液pH值、離子強度、解離液pH值等因素的影響，其中最佳的分離條件為結(jié)合液pH7.5、NaCl濃度0.5mol/L，解離液pH5.0和吸附時間2h，最大SOD比活力為3252U/mg，最大回收率可達到91.23%。結(jié)果也顯示，磁性納米粒子對不同濃度的SOD吸附擬合Langmuir吸附模型，SOD最大的載荷為166.7mg/g，解離常數(shù)Kd為0.32mg/mL，采用該數(shù)學(xué)模型，可以較好的預(yù)測磁性納米粒子對SOD吸附作用規(guī)律。本實驗建立的方法為快速分離純化蛋白質(zhì)提供一定得借鑒。

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