張明穎，孫國(guó)祥（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110016）

阿托伐他汀鈣是羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑類調(diào)血脂藥，可降低血清膽固醇和甘油三酯水平，副作用小，臨床用于治療多種高膽固醇血癥和混合性脂代謝紊亂癥[1]。阿托伐他汀鈣原料藥在合成過程中的中間體有4-氟苯基芐基酮（FPAP）、4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺（M-2）和（4R-cis）-6-[2-[2-（4-氟苯基）-5-（1-異丙基）-3-苯基-4-[（苯胺）羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2，2-二甲基-1，3-二氧六環(huán)-4-乙酸叔丁酯（L-1）[2-4]，3種中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 3種中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig1 Chemical structures of 3 intermediates

為控制該原料藥質(zhì)量，筆者參照有關(guān)文獻(xiàn)[5-11]采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)FPAP、M-2和L-1這3種中間體進(jìn)行含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查，制定3種中間體的合適的質(zhì)量限度以保證阿托伐他汀鈣產(chǎn)品的質(zhì)量合格。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀，配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、四元低壓梯度泵和自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation工作站（美國(guó)Agilent科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

FPAP、M-2、L-1對(duì)照品（批號(hào)：091025、091026、091027，純度：99.7%、99.1%、99.8%）與FPAP、M-2和L-1樣品（各3批，批號(hào)均為：20100101、20100102、20100103，純度：均＞98.0%）均為自制；甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，枸櫞酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液。精密稱取FPAP、M-2和L-1對(duì)照品適量，分別使用乙腈-50 mmol/L枸櫞酸銨溶液（pH7.4）（1∶1，V/V）、甲醇-水（80∶20，V/V）和甲醇為配樣溶液制成質(zhì)量濃度分別為20、50、50 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液。精密稱取FPAP、M-2和L-1樣品適量（分別約10、25、25 mg），置于50 ml量瓶中，分別取“2.1.1”項(xiàng)下配樣溶液溶解并定容，搖勻，過濾；取續(xù)濾液適量用配樣溶液制備成質(zhì)量濃度分別為20、50、50 μg/ml的供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

測(cè)定3種中間體的色譜柱和流動(dòng)相組成條件見表1。

表1 測(cè)定3種中間體的色譜條件和理論板數(shù)Tab1 Chromatographic conditions and theory plate number of 3 intermediates

其余條件為：流動(dòng)相流速為1.0 ml/min，柱溫為（30±0.15）℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為244 nm，進(jìn)樣量為20 μl。精密吸取3種中間體對(duì)照品溶液在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，理論板數(shù)結(jié)果見表1，表明本色譜條件適用性良好。

2.3 方法專屬性考察

分別取3種中間體各自的配樣溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明配樣溶液不干擾中間體的含量測(cè)定，色譜圖見圖2。

圖2 3種中間體的高效液相色譜圖A.FPAP；B.M-2；C.L-1；a.配樣溶液；b.供試品；c.對(duì)照品Fig2 HPLC chromatograms of 3 intermediatesA.FPAP；B.M-2；C.L-1；a.blank solvent；b.test sample；c.substance control

另取3種中間體供試品溶液分別在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下進(jìn)行破壞試驗(yàn)，結(jié)果表明主成分峰與各降解產(chǎn)物能達(dá)到很好的分離。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取FPAP、M-2、L-1對(duì)照品各10 mg，置于50 ml量瓶中，各自加入相應(yīng)的配樣溶液溶解并定容，搖勻，作為貯備液。精密量取各貯備液適量用配樣溶液按表2制備成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取5種系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μl，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定2次，記錄色譜圖，以平均峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸得到3種中間體的線性方程；調(diào)整對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度按3倍信噪比確定檢測(cè)限，按10倍信噪比確定定量限，結(jié)果見表2。

2.5 進(jìn)樣精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率試驗(yàn)

精密稱取FPAP、M-2和L-1對(duì)照品按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成3種中間體的對(duì)照品溶液，分別精密吸取3種中間體對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣分析5次以考察精密度；FPAP對(duì)照品溶液分別在0、2、4、5、6 h進(jìn)樣測(cè)定，M-2和L-1對(duì)照品溶液分別在0、1、3、5、7 h進(jìn)樣測(cè)定以考察穩(wěn)定性；按供試品溶液質(zhì)量濃度的80%、100%、120%分別制備3種中間體的對(duì)照品溶液，各濃度制備3份，每份測(cè)定2次以考察回收率；重復(fù)制備5份供試品溶液分別測(cè)定以考察重復(fù)性。各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明FPAP供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定，M-2和L-1供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定；3種中間體的精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性及樣品穩(wěn)定性均合格，詳見表3。

表2 3種中間體的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限Tab2 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 3 intermediates

表3 3種中間體的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率結(jié)果（%%）Tab3 Precision，stability，repeatability and average recovery of 3 intermediates（%%）

2.6 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取3種中間體供試品溶液測(cè)定2次，以平均峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3種中間體各3批樣品的含量。結(jié)果，F(xiàn)PAP 3批樣品中FPAP含量分別為98.54%、98.48%、98.77%（≥98%）；M-2 3批樣品中M-2含量分別為98.69%、99.38%、99.13%（≥98%）；L-1 3批樣品中L-1的含量分別為99.13%、99.77%、99.11%（≥99%）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定FPAP、M-2和L-1 3種中間體的含量應(yīng)分別不低于98%、98%和99%。

2.7 樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

2.7.1 溶液制備。供試溶液制備：取FPAP、M-2和L-1樣品適量以各自的配樣溶液制成質(zhì)量濃度分別為200、500、500μg/ml的供試溶液。對(duì)照溶液制備：精密吸取上述1 ml供試溶液，置于100 ml量瓶中，分別加配樣溶液溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.7.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。分別吸取3種中間體的供試溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍，再吸取對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的20%，記錄色譜圖。按主成分自身對(duì)照法計(jì)算3種中間體中有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果3批FPAP樣品中的有關(guān)物質(zhì)分別為0.27%、0.28%、0.28%（＜0.5%），3批M-1樣品中的有關(guān)物質(zhì)分別為0.86%、0.95%、0.92%（＜1%），3批L-1樣品中有關(guān)物質(zhì)分別為0.16%、0.18%、0.15%（＜0.5%）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定FPAP、M-2和L-1 3種中間體的有關(guān)物質(zhì)應(yīng)分別小于＜0.5%、1%、0.5%。色譜圖見圖3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

中間體FPAP、M-2和L-1經(jīng)紫外掃描最大吸收波長(zhǎng)分別為244、243和240 nm。用相應(yīng)的色譜條件對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種中間體在244 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，而且在此波長(zhǎng)下由破壞試驗(yàn)所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能被靈敏地檢測(cè)出，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為244 nm。

圖3 3種中間體有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的高效液相色譜圖Fig3 HPLC chromatograms of related substances of 3 intermediates

3.2 流動(dòng)相及配樣溶液的選擇

筆者對(duì)中間體FPAP的流動(dòng)相進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在阿托伐他汀鈣原料藥的色譜條件下可以實(shí)現(xiàn)FPAP與其有關(guān)物質(zhì)的有效分離，為了后續(xù)的相關(guān)研究，故采用乙腈-四氫呋喃-枸櫞酸銨體系作為FPAP的流動(dòng)相，并采用乙腈-枸櫞酸銨為配樣溶液。

對(duì)中間體M-2和L-1的流動(dòng)相進(jìn)行篩選考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)原料藥的色譜條件不能使二者與有其關(guān)物質(zhì)有效分離，因?yàn)镸-2和L-1均易溶于甲醇，考慮到毒性及成本的因素故采用甲醇-水體系考察二者的流動(dòng)相組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)M-2的流動(dòng)相甲醇-水比例為60∶40時(shí)主峰與有關(guān)物質(zhì)分離良好，在此基礎(chǔ)上提高有機(jī)相比例主峰峰形變寬，降低有機(jī)相比例主峰峰形不佳且分離度下降；向流動(dòng)相中加入磷酸鹽后可明顯改善主峰拖尾現(xiàn)象，可能是因?yàn)榱姿猁}對(duì)色譜柱的羥基有改性作用并且可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值使M-2與其有關(guān)物質(zhì)分離度提高；另因?yàn)槿芙庑孕?yīng)M-2峰形有前沿現(xiàn)象，向配樣溶液甲醇中加入20%的水可以有效改善主峰前沿。因此M-2流動(dòng)相選用甲醇-50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（60∶40），配樣溶液選用甲醇-水（80∶20）。中間體L-1的流動(dòng)相甲醇-水比例為85∶15時(shí)主峰與其有關(guān)物質(zhì)能有效分離且峰形較好，若減少有機(jī)相比例則主峰峰形變寬且與有關(guān)物質(zhì)的分離度降低，故L-1流動(dòng)相選用甲醇-水（85∶15），配樣溶液選用甲醇。

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀鈣3種中間體FPAP、M-2和L-1的含量測(cè)定方法和有關(guān)物質(zhì)檢查方法，結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于阿托伐他汀鈣3種中間體的質(zhì)量控制。控制好3種中間體的質(zhì)量是確保阿托伐他汀鈣有關(guān)物質(zhì)含量低和產(chǎn)品純度高的必要前提。本研究對(duì)于阿托伐他汀鈣原料藥生產(chǎn)過程的控制具有較重要的意義。

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