張明穎,孫國(guó)祥(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院,沈陽(yáng)110016)
阿托伐他汀鈣是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑類調(diào)血脂藥,可降低血清膽固醇和甘油三酯水平,副作用小,臨床用于治療多種高膽固醇血癥和混合性脂代謝紊亂癥[1]。阿托伐他汀鈣原料藥在合成過程中的中間體有4-氟苯基芐基酮(FPAP)、4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺(M-2)和(4R-cis)-6-[2-[2-(4-氟苯基)-5-(1-異丙基)-3-苯基-4-[(苯胺)羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)-4-乙酸叔丁酯(L-1)[2-4],3種中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。
圖1 3種中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig1 Chemical structures of 3 intermediates
為控制該原料藥質(zhì)量,筆者參照有關(guān)文獻(xiàn)[5-11]采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)FPAP、M-2和L-1這3種中間體進(jìn)行含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查,制定3種中間體的合適的質(zhì)量限度以保證阿托伐他汀鈣產(chǎn)品的質(zhì)量合格。
Agilent 1100型HPLC儀,配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、四元低壓梯度泵和自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation工作站(美國(guó)Agilent科技有限公司)。
FPAP、M-2、L-1對(duì)照品(批號(hào):091025、091026、091027,純度:99.7%、99.1%、99.8%)與FPAP、M-2和L-1樣品(各3批,批號(hào)均為:20100101、20100102、20100103,純度:均>98.0%)均為自制;甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純,枸櫞酸為分析純,水為去離子水。
2.1.1 對(duì)照品溶液。精密稱取FPAP、M-2和L-1對(duì)照品適量,分別使用乙腈-50 mmol/L枸櫞酸銨溶液(pH7.4)(1∶1,V/V)、甲醇-水(80∶20,V/V)和甲醇為配樣溶液制成質(zhì)量濃度分別為20、50、50 μg/ml的對(duì)照品溶液。
2.1.2 供試品溶液。精密稱取FPAP、M-2和L-1樣品適量(分別約10、25、25 mg),置于50 ml量瓶中,分別取“2.1.1”項(xiàng)下配樣溶液溶解并定容,搖勻,過濾;取續(xù)濾液適量用配樣溶液制備成質(zhì)量濃度分別為20、50、50 μg/ml的供試品溶液。
測(cè)定3種中間體的色譜柱和流動(dòng)相組成條件見表1。
表1 測(cè)定3種中間體的色譜條件和理論板數(shù)Tab1 Chromatographic conditions and theory plate number of 3 intermediates
其余條件為:流動(dòng)相流速為1.0 ml/min,柱溫為(30±0.15)℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為244 nm,進(jìn)樣量為20 μl。精密吸取3種中間體對(duì)照品溶液在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,理論板數(shù)結(jié)果見表1,表明本色譜條件適用性良好。
分別取3種中間體各自的配樣溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果表明配樣溶液不干擾中間體的含量測(cè)定,色譜圖見圖2。
圖2 3種中間體的高效液相色譜圖A.FPAP;B.M-2;C.L-1;a.配樣溶液;b.供試品;c.對(duì)照品Fig2 HPLC chromatograms of 3 intermediatesA.FPAP;B.M-2;C.L-1;a.blank solvent;b.test sample;c.substance control
另取3種中間體供試品溶液分別在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下進(jìn)行破壞試驗(yàn),結(jié)果表明主成分峰與各降解產(chǎn)物能達(dá)到很好的分離。
精密稱取FPAP、M-2、L-1對(duì)照品各10 mg,置于50 ml量瓶中,各自加入相應(yīng)的配樣溶液溶解并定容,搖勻,作為貯備液。精密量取各貯備液適量用配樣溶液按表2制備成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取5種系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μl,在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定2次,記錄色譜圖,以平均峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(c)進(jìn)行回歸得到3種中間體的線性方程;調(diào)整對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度按3倍信噪比確定檢測(cè)限,按10倍信噪比確定定量限,結(jié)果見表2。
精密稱取FPAP、M-2和L-1對(duì)照品按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成3種中間體的對(duì)照品溶液,分別精密吸取3種中間體對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣分析5次以考察精密度;FPAP對(duì)照品溶液分別在0、2、4、5、6 h進(jìn)樣測(cè)定,M-2和L-1對(duì)照品溶液分別在0、1、3、5、7 h進(jìn)樣測(cè)定以考察穩(wěn)定性;按供試品溶液質(zhì)量濃度的80%、100%、120%分別制備3種中間體的對(duì)照品溶液,各濃度制備3份,每份測(cè)定2次以考察回收率;重復(fù)制備5份供試品溶液分別測(cè)定以考察重復(fù)性。各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明FPAP供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定,M-2和L-1供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定;3種中間體的精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性及樣品穩(wěn)定性均合格,詳見表3。
表2 3種中間體的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限Tab2 Linear equation,correlation coefficient,LOD and LOQ of 3 intermediates
表3 3種中間體的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率結(jié)果(%%)Tab3 Precision,stability,repeatability and average recovery of 3 intermediates(%%)
分別精密吸取3種中間體供試品溶液測(cè)定2次,以平均峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3種中間體各3批樣品的含量。結(jié)果,F(xiàn)PAP 3批樣品中FPAP含量分別為98.54%、98.48%、98.77%(≥98%);M-2 3批樣品中M-2含量分別為98.69%、99.38%、99.13%(≥98%);L-1 3批樣品中L-1的含量分別為99.13%、99.77%、99.11%(≥99%)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定FPAP、M-2和L-1 3種中間體的含量應(yīng)分別不低于98%、98%和99%。
2.7.1 溶液制備。供試溶液制備:取FPAP、M-2和L-1樣品適量以各自的配樣溶液制成質(zhì)量濃度分別為200、500、500μg/ml的供試溶液。對(duì)照溶液制備:精密吸取上述1 ml供試溶液,置于100 ml量瓶中,分別加配樣溶液溶解并定容至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液。
2.7.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。分別吸取3種中間體的供試溶液進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍,再吸取對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主成分色譜峰高約為滿量程的20%,記錄色譜圖。按主成分自身對(duì)照法計(jì)算3種中間體中有關(guān)物質(zhì)的含量,結(jié)果3批FPAP樣品中的有關(guān)物質(zhì)分別為0.27%、0.28%、0.28%(<0.5%),3批M-1樣品中的有關(guān)物質(zhì)分別為0.86%、0.95%、0.92%(<1%),3批L-1樣品中有關(guān)物質(zhì)分別為0.16%、0.18%、0.15%(<0.5%)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定FPAP、M-2和L-1 3種中間體的有關(guān)物質(zhì)應(yīng)分別小于<0.5%、1%、0.5%。色譜圖見圖3。
中間體FPAP、M-2和L-1經(jīng)紫外掃描最大吸收波長(zhǎng)分別為244、243和240 nm。用相應(yīng)的色譜條件對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種中間體在244 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收,而且在此波長(zhǎng)下由破壞試驗(yàn)所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能被靈敏地檢測(cè)出,故檢測(cè)波長(zhǎng)定為244 nm。
圖3 3種中間體有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的高效液相色譜圖Fig3 HPLC chromatograms of related substances of 3 intermediates
筆者對(duì)中間體FPAP的流動(dòng)相進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)在阿托伐他汀鈣原料藥的色譜條件下可以實(shí)現(xiàn)FPAP與其有關(guān)物質(zhì)的有效分離,為了后續(xù)的相關(guān)研究,故采用乙腈-四氫呋喃-枸櫞酸銨體系作為FPAP的流動(dòng)相,并采用乙腈-枸櫞酸銨為配樣溶液。
對(duì)中間體M-2和L-1的流動(dòng)相進(jìn)行篩選考察時(shí),發(fā)現(xiàn)原料藥的色譜條件不能使二者與有其關(guān)物質(zhì)有效分離,因?yàn)镸-2和L-1均易溶于甲醇,考慮到毒性及成本的因素故采用甲醇-水體系考察二者的流動(dòng)相組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)M-2的流動(dòng)相甲醇-水比例為60∶40時(shí)主峰與有關(guān)物質(zhì)分離良好,在此基礎(chǔ)上提高有機(jī)相比例主峰峰形變寬,降低有機(jī)相比例主峰峰形不佳且分離度下降;向流動(dòng)相中加入磷酸鹽后可明顯改善主峰拖尾現(xiàn)象,可能是因?yàn)榱姿猁}對(duì)色譜柱的羥基有改性作用并且可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值使M-2與其有關(guān)物質(zhì)分離度提高;另因?yàn)槿芙庑孕?yīng)M-2峰形有前沿現(xiàn)象,向配樣溶液甲醇中加入20%的水可以有效改善主峰前沿。因此M-2流動(dòng)相選用甲醇-50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(60∶40),配樣溶液選用甲醇-水(80∶20)。中間體L-1的流動(dòng)相甲醇-水比例為85∶15時(shí)主峰與其有關(guān)物質(zhì)能有效分離且峰形較好,若減少有機(jī)相比例則主峰峰形變寬且與有關(guān)物質(zhì)的分離度降低,故L-1流動(dòng)相選用甲醇-水(85∶15),配樣溶液選用甲醇。
本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀鈣3種中間體FPAP、M-2和L-1的含量測(cè)定方法和有關(guān)物質(zhì)檢查方法,結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于阿托伐他汀鈣3種中間體的質(zhì)量控制。控制好3種中間體的質(zhì)量是確保阿托伐他汀鈣有關(guān)物質(zhì)含量低和產(chǎn)品純度高的必要前提。本研究對(duì)于阿托伐他汀鈣原料藥生產(chǎn)過程的控制具有較重要的意義。
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