王虎斌，韋超，趙日秋，喬紅群#（.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京0009；.南京生命能科技開發(fā)有限公司，南京 006）

拉坦前列素（Latanoprost）是1996年開發(fā)出的治療青光眼和高眼壓的新藥。其是一種新型苯基替代的丙基酯前列素F2a，為選擇性F2a受體激動藥，無活性但能迅速滲透到角膜里，在角膜和血漿中可水解為具有活性的游離酸。拉坦前列素用量小，但房水通過眼角素層的流出量大，藥液能滲透到眼球上睫脈絡(luò)膜上層，具有良好降眼壓效果[1-2]。自前列腺素衍生物應(yīng)用以來，國內(nèi)外已有許多研究[3-4]證明，拉坦前列素對原發(fā)性開角型青光眼和高眼壓癥有明顯的降眼壓作用。目前國家要求市場上的滴眼液必須選擇合適的抑菌劑，苯扎氯銨是一種陽離子表面活性劑，屬非氧化性殺菌劑，具有廣譜、高效的抑菌效力，且用量適當(dāng)時無任何不良反應(yīng)，故本試驗中采用苯扎氯銨作為拉坦前列素滴眼液的抑菌劑。另根據(jù)文獻[5]報道，綜合考慮苯扎氯銨的有效劑量以及眼部毒性，對0.005%（0.005g/100ml）、0.01%、0.015%、0.02%4個處方量進行本次研究的篩選。本研究根據(jù)2010年版《中國藥典》（二部）抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則[6]要求，測定含不同處方量抑菌劑的拉坦前列素滴眼液對5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效力，從而確定處方中苯扎氯銨的使用量。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備

AKL1300C超凈臺（蘇州市艾可林實驗動物器材廠）；臺式滅菌器3870（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；微量移液槍（德國Ependoff公司，規(guī)格：20μl、500μl、5ml）。

1.2 藥品、培養(yǎng)基與試劑

拉坦前列素滴眼液，處方Ⅰ（批號：20100817-1，0.005%苯扎氯銨）、處方Ⅱ（批號：20100817-2，0.01%苯扎氯銨）、處方Ⅲ（批號：20100817-3，0.015%苯扎氯銨）、處方Ⅳ（批號：20100817-4，0.02%苯扎氯銨）均由南京生命能科技開發(fā)有限公司提供；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（批號：100518）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：1003012）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供；0.9%氯化鈉注射液（南京小營藥業(yè)集團有限公司，批號：2010070106）。

1.3 菌株

銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由江蘇省食品藥品檢驗所提供，所有菌株傳代次數(shù)均為第3代。

2 方法

2.1 檢測菌菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48h。用0.9%氯化鈉注射液將上述培養(yǎng)物的菌懸液校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)濃度（含菌數(shù)約為108CFU/ml），最后用0.9%氯化鈉注射液將菌液1→10稀釋至每1ml含菌數(shù)為50～100CFU的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7d，加入5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液制成每1ml含孢子數(shù)50～100CFU的孢子懸液。

2.2 計數(shù)方法的驗證

驗證試驗進行3次獨立的平行試驗，并分別按公式（回收率＝試驗組平均菌數(shù)/菌液組平均菌數(shù)×100%）計算各試驗菌每次試驗的回收率。

2.2.1 菌液組。取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌稀釋菌液各1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置于35℃培養(yǎng)48h，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉稀釋菌液各1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置25℃培養(yǎng)72h，計數(shù)。

2.2.2 試驗組。取4種處方供試液1ml和50～100CFU試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.3 抑菌效力測定

取包裝完整的4種處方的供試品各20瓶，直接接種“2.1”項下制備的含菌數(shù)約為108CFU/ml的試驗菌菌液，每一試驗菌菌液接種4瓶，供試品中1ml接種菌數(shù)約為105～106CFU，每支接種菌液的體積25μl，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布。將接種的供試品置于25℃培養(yǎng)28d，避光，同時在0、7、14、28d分別依法檢測供試液中的菌落數(shù)。菌落數(shù)檢測方法：用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將供試液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶1077個稀釋級，取各級稀釋液1ml，置于無菌平皿中，注入20ml胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待凝固，倒置培養(yǎng)。每個稀釋級每種培養(yǎng)基制備2個平皿；測定每份供試品中所含的菌數(shù)。同時取稀釋液作陰性對照。根據(jù)《中國藥典》規(guī)定，抑菌劑效力根據(jù)各間隔時間的菌數(shù)lg值相對于初始值（0時菌數(shù)lg值）減少程度進行評價。

3 結(jié)果

結(jié)果，4種處方樣品3次計數(shù)方法驗證試驗的回收率均在70%以上，表明該樣品可采用普通的菌落計數(shù)方法。4種處方對5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的回收率試驗結(jié)果見表1，4種處方對5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效力見圖1。

表1 4種處方對5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests for 5kinds of standard strains in 4kinds of formulation

圖1 4種處方對5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效力A.處方Ⅰ；B.處方Ⅱ；C.處方Ⅲ；D.處方ⅣFig 1 Antibacterial effects of 5standard strains in 4kinds of formulationA.formulationⅠ；B.formulationⅡ；C.formulationⅢ；D.formulationⅣ

從圖1結(jié)果可看出，處方Ⅰ和處方Ⅱ?qū)︺~綠假單孢菌的抑菌效力不符合《中國藥典》要求，而處方Ⅲ和處方Ⅳ均可以在28d內(nèi)抑制5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌體生長。由于處方Ⅲ的抑菌劑量比處方Ⅳ低，所以拉坦前列素滴眼液中苯扎氯銨的處方量建議為0.015%。

4 討論

拉坦前列素是以異丙酯為存在形式的前體藥物，其通過角膜被吸收，在酯酶的作用下水解成具有生物活性的酸，以增加房水的鞏膜色素膜外流達到降低眼內(nèi)壓的作用。拉坦前列素因能逐漸改變眼的顏色，而被作為治療開角型青光眼的二線藥物[1]。本試驗主要探討了拉坦前列素滴眼液處方中抑菌劑苯扎氯銨的合理含量，為拉坦前列素的臨床應(yīng)用提供了試驗依據(jù)。

2010年版《中國藥典》中抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則對眼用制劑抑菌劑的使用有具體的規(guī)定[6]，為抑菌劑的合理使用指明了方向。本次試驗主要探討了處方中不同量抑菌劑對藥物的影響，所以處方中其他組分及其濃度均相同，以后的試驗可以對拉坦前列素滴眼液中其他組分對處方的影響進行研究。

[1] 張翠蓮.拉坦前列素[J].中國新藥雜志，1998，7（4）：329.

[2] 詹桂林.前列腺素治療青光眼的最新進展[J].國外醫(yī)學(xué)眼科學(xué)分冊，1997，21（3）：129.

[3] 陳璐，童榮生，呂晶.降眼壓新藥：曲伏前列素[J].中國藥房，2008，19（25）：1981.

[4] Aptel F，Cucherat M，Denis P.Efficacy and tolerability of prostaglandin analogs：a meta-analysis of randomized controlled clinical trials[J].J Glaucoma，2008，17（8）：667.

[5] 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42（23）：1836.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅪⅩN.