王俊蘇，郗存顯，陳冬東，張雷，李賢良，彭濤，王國(guó)民#（.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局/重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶 40000；.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 003）

雙胍類(lèi)藥物用于糖尿病治療始于20世紀(jì)50年代，其中二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線(xiàn)藥物，但過(guò)度服用會(huì)導(dǎo)致乳酸酸中毒，危及患者生命[1]；苯乙雙胍也因其可致較高的乳酸酸中毒發(fā)生率，在歐美國(guó)家已停止使用，在我國(guó)也已趨于淘汰[2]。由于雙胍類(lèi)藥物的降血糖效果較好，一些不法分子在降血糖保健食品中違禁添加了這類(lèi)藥物，而長(zhǎng)期超量服用這些保健食品會(huì)嚴(yán)重危害患者的身體健康。為此，需要建立測(cè)定這類(lèi)保健食品中雙胍類(lèi)藥物的快速、可靠的方法。

目前，降血糖類(lèi)保健食品中雙胍類(lèi)藥物的測(cè)定方法主要有毛細(xì)管電泳法[3]、薄層色譜法[4-6]、高效液相色譜（HPLC）法[4-9]和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[10-11]。其中，毛細(xì)管電泳法和薄層色譜法的選擇性較差，檢測(cè)結(jié)果容易受到其他因素的干擾；HPLC法具有快速、高分離度的優(yōu)點(diǎn)，但多數(shù)方法未建立樣品的凈化方法[4-7]。由于保健食品成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾嚴(yán)重[12]，加之雙胍類(lèi)藥物的極性強(qiáng)，在反相C18柱上保留時(shí)間較短，與雜質(zhì)分離效果差，因此，采用HPLC測(cè)定時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化，以提高方法的可靠性和靈敏度。

筆者采用超聲法提取降血糖保健食品中的二甲雙胍和苯乙雙胍，將提取液經(jīng)弱陽(yáng)離子型WCX固相萃取柱凈化后再進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果表明方法簡(jiǎn)單、可靠、靈敏。具體報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD，美國(guó)Agilent公司）；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；3-30K型離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；N-EVAP 116型氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；AS20500BDT型超聲波清洗器（天津市奧特賽恩斯儀器有限公司）；HH型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠(chǎng)）。

LC-WCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱、LC-18固相萃取柱（美國(guó)Supelco公司）；MCX固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

二甲雙胍標(biāo)準(zhǔn)品（鹽酸鹽，批號(hào)：100664-200602，純度：＞99%）、苯乙雙胍標(biāo)準(zhǔn)品（鹽酸鹽，批號(hào)：100922-201001，純度：＞99%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈、冰醋酸、庚烷磺酸鈉均為色譜純；無(wú)水乙醇、磷酸、磷酸氫二鉀均為分析純；試樣基質(zhì)（降糖粉，A公司，生產(chǎn)日期：20090805，規(guī)格：每袋1 kg；奶粉，B公司，生產(chǎn)日期：20100120，規(guī)格：每袋300 g；口服液，C公司，生產(chǎn)日期：20080919，規(guī)格：每瓶250 ml；膠囊，D公司，生產(chǎn)日期：20090806，規(guī)格：250 mg×10粒×4板；清渴茶，E公司，生產(chǎn)日期：20100102，規(guī)格：每盒150 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精確稱(chēng)取二甲雙胍、苯乙雙胍標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），用適量甲醇溶解并定容至100 ml，混勻，制備成二甲雙胍、苯乙雙胍質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別精密量取二甲雙胍和苯乙雙胍貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀釋、定容，制備成二甲雙胍、苯乙雙胍質(zhì)量濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 樣品的提取與凈化

2.2.1 提取。稱(chēng)取1.0 g（精確到0.01 g）試樣于50 ml離心管中，加入10 ml甲醇-乙醇（50∶50，V/V），于旋渦混合器上混勻，超聲10 min，7 000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上層清液至100 ml旋蒸瓶中，再分別用10 ml甲醇-乙醇（50∶50，V/V）重復(fù)提取2次，合并上清液，旋蒸濃縮近干，用2 ml甲醇溶解殘?jiān)?，再加? ml水，混勻，待凈化。

2.2.2 凈化。LC-WCX固相萃取柱使用前依次用3 ml甲醇和3 ml水活化。將待凈化液全部轉(zhuǎn)移至LC-WCX固相萃取柱中，用3 ml甲醇-水（50∶50，V/V）淋洗小柱，抽空，再用5 ml 3%乙酸甲醇溶液（取3 ml冰乙酸與97 ml甲醇混合即得）洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.0 ml流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC測(cè)定。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為含庚烷磺酸鈉-磷酸氫二鉀的磷酸溶液（稱(chēng)取庚烷磺酸鈉2.023 g、磷酸氫二鉀2.282 g到500 ml量瓶中，再取1 ml用水溶解并定容，過(guò)0.45 μm濾膜，即得），流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱后平衡時(shí)間：3 min；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution program of mobile phase

2.4 色譜專(zhuān)屬性考察

取“2.1.2”項(xiàng)下二甲雙胍和苯乙雙胍質(zhì)量濃度均為5.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果，二甲雙胍和苯乙雙胍的保留時(shí)間分別為8.5、17.9 min。稱(chēng)取試樣清渴茶，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取和凈化后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；另取試樣清渴茶樣品，按5.0 mg/kg量添加二甲雙胍和苯乙雙胍后按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取、凈化后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，試樣清渴茶經(jīng)提取、凈化后不存在干擾二甲雙胍和苯乙雙胍測(cè)定的物質(zhì)。色譜見(jiàn)圖1。

2.5 基質(zhì)回收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

圖1 高效液相色譜圖A.混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；B.試樣；C.試樣+混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；1.二甲雙胍；2.苯乙雙胍Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed standard substance；B.test sample；C.test sample+mixed standard substance；1.metformin；2.phenformin

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣1.0 g（精確至0.01g）于50 ml離心管中，分別加入“2.1.2”項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法提取、凈化，進(jìn)樣分析；以質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)回收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果，二甲雙胍和苯乙雙胍的標(biāo)準(zhǔn)方程分別為y＝47.75x+0.21（r＝0.999 9）、y＝38.48x+1.33（r＝0.999 5），二者檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍均為0.1～5.0 mg/L。

2.6 定量限考察

分別稱(chēng)取1.0 g（精確到0.01 g）清渴茶試樣共6份按0.1 mg/kg的量分別添加二甲雙胍和苯乙雙胍，并按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取、凈化后進(jìn)樣分析，計(jì)算信噪比。結(jié)果表明，二甲雙胍和苯乙雙胍的信噪比均大于10，因此將二甲雙胍和苯乙雙胍的定量限定為0.1 μg/g。

2.7 回收率和精密度

文獻(xiàn)[4-8]均報(bào)道了1～3種保健食品試樣中雙胍類(lèi)藥物的測(cè)定方法。本試驗(yàn)采用的試樣基質(zhì)有降糖粉、奶粉、口服液、膠囊、清渴茶5種保健食品，幾乎涵蓋了糖尿病患者服用的保健食品的所有種類(lèi)，保障了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的代表性和檢測(cè)方法的適用性。采用上述基質(zhì)，分別按照1.0、2.0、5.0 mg/kg 3個(gè)水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平分析6次。結(jié)果，二甲雙胍和苯乙雙胍的平均回收率分別為91.9%～102.7%、89.8%～107.0%，RSD均小于9.46%，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 試樣分析

取5種試樣，分別進(jìn)行提取、凈化后進(jìn)樣分析，結(jié)果，5種試樣中均未檢出二甲雙胍和苯乙雙胍。

3 分析與討論

3.1 提取溶劑的選擇

以清渴茶為基質(zhì)，按1 mg/kg添加二甲雙胍和苯乙雙胍，考察不同溶劑（甲醇、乙醇、乙腈及混合溶劑）對(duì)雙胍類(lèi)藥物的提取效率，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，甲醇-乙醇（50∶50，V/V，含3%乙酸）及甲醇-乙醇（50∶50，V/V）對(duì)二甲雙胍和苯乙雙胍的提取效率較其他溶劑好。由于2種提取溶劑中二甲雙胍的回收率都在80%以上，故根據(jù)苯乙雙胍的回收率值的高低來(lái)選取提取溶劑。其中甲醇-乙醇（50∶50，V/V）作為提取溶劑時(shí)苯乙雙胍的回收率相對(duì)較高，故最終以其為提取溶劑，并采用基質(zhì)回收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，以彌補(bǔ)添加水平較低時(shí)前處理過(guò)程中雙胍類(lèi)藥物的損失，可使回收率滿(mǎn)足要求。

表2 二甲雙胍和苯乙雙胍的回收率結(jié)果（n＝6）Tab 2Recovery rates of metformin and phenformin（n＝6）

表3 不同提取溶劑對(duì)二甲雙胍和苯乙雙胍回收率的影響Tab3 Influence of different extraction solvent on recoveries of metformin and phenformin

3.2 提取方式的選擇

前期試驗(yàn)比較了超聲波提取、旋渦振蕩提取和微波提取3種提取方式的提取效果。結(jié)果顯示超聲波和旋渦振蕩均能提高提取效率，而微波提取對(duì)回收率沒(méi)有明顯的影響，因此選用先旋渦振蕩后超聲提取10 min的提取方式。

3.3 固相萃取柱和洗脫溶劑的選擇

固相萃取是一種基于“相似相溶”原理進(jìn)行分離和凈化的技術(shù)[13]。前期試驗(yàn)中比較了LC-WCX、MCX、HLB、LC-18等固相萃取柱對(duì)樣品的凈化效果；同時(shí)，試驗(yàn)了甲醇、5%氨化甲醇（取5 ml氨水與95 ml甲醇混合即得）、3%乙酸甲醇作為洗脫溶劑的洗脫效率。結(jié)果表明，雙胍類(lèi)藥物在HLB和LC-18柱上基本不保留；而由于雙胍類(lèi)藥物與強(qiáng)陽(yáng)離子型MCX柱中的陰離子作用力較強(qiáng)，采用MCX柱時(shí)3種洗脫溶劑均難以洗脫藥物，只有采用文獻(xiàn)[8]中較強(qiáng)的甲醇-0.4 mol/L氫氧化鈉溶液（60∶40，V/V）才能有效地洗脫，故MCX柱不適合采用；采用作用力相對(duì)較弱的弱陽(yáng)離子型LC-WCX柱凈化時(shí)，以3%乙酸甲醇溶液作為洗脫溶劑，利用溶劑中的氫離子（H+）與LC-WCX柱上吸附的雙胍類(lèi)藥物發(fā)生離子交換，使之解離而被有效地洗脫。因此，本試驗(yàn)最終采用LC-WCX柱，以5 ml、3%乙酸甲醇溶液作為洗脫溶劑用于樣品的凈化。

3.4 液相色譜柱的選擇

反相C18色譜柱常用于雙胍類(lèi)藥物的分離[4-9]。由于雙胍類(lèi)藥物屬于強(qiáng)極性含氮化合物，在反相色譜柱上保留較差，同時(shí)還容易產(chǎn)生二次保留作用，從而發(fā)生色譜峰拖尾現(xiàn)象[8]。在流動(dòng)相中加入酸性緩沖鹽[6-8]，或加入庚烷磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉[4-5]等離子對(duì)試劑，能夠抑制雙胍類(lèi)藥物的電離，增強(qiáng)雙胍類(lèi)藥物的保留和避免拖尾。前期曾試驗(yàn)用Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）、Waters Xetrra MS C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）、Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種反相色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，并在流動(dòng)相中加入磷酸鹽緩沖液和0.01 mol/L庚烷磺酸鈉對(duì)雙胍類(lèi)藥物進(jìn)行分離。結(jié)果表明，Shimadzu VP-ODS C18、Waters Xetrra MS C18不能很好地保留二甲雙胍，出峰時(shí)間較快，峰形不好；Agilent SB-C18對(duì)二甲雙胍和苯乙雙胍都能很好地保留，峰形較好，響應(yīng)強(qiáng)度較高。因此本試驗(yàn)采用Agilent SB-C18色譜柱分離二甲雙胍和苯乙雙胍。

筆者建立了同時(shí)測(cè)定降血糖類(lèi)保健食品中二甲雙胍和苯乙雙胍的HPLC方法。方法采用基質(zhì)回收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量，解決了添加濃度較低時(shí)回收率較低的問(wèn)題；建立了弱陽(yáng)離子型固相萃取柱凈化方法，能有效去除雜質(zhì)的干擾；研究了降糖粉、奶粉、口服液、膠囊、清渴茶5種基質(zhì)中雙胍類(lèi)藥物的回收率，保障了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的代表性和檢測(cè)方法的實(shí)用性。結(jié)果表明，建立的方法線(xiàn)性范圍寬、精密度高、回收率較好，具有簡(jiǎn)單、可靠、靈敏等特點(diǎn)，可用于降血糖保健食品中雙胍類(lèi)藥物的監(jiān)測(cè)。

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